Kif Tagħżel it-Tubu Ultrafiltrazzjoni Xieraq
Tubi ta 'ultrafiltrazzjoni użati komunement għall-konċentrazzjoni tal-proteina u s-sostituzzjoni tal-buffer spiss jintużaw f'tubi ta' ultrafiltrazzjoni. Hemm mudelli oħra, li għandhom daqsijiet ta' volum u tubi ta' ultrafiltrazzjoni differenti, skont il-piż molekulari tal-proteina fil-mira, il-volum qabel il-konċentrazzjoni u l-volum fil-mira tal-konċentrazzjoni. Jista' jerġa' jintuża.
1. Agħżel tubu ta 'l-ultrafiltrazzjoni xieraq, prinċipalment meta wieħed iqis MWCO u l-volum ta' konċentrazzjoni. Ġeneralment, il- piż molekulari m' għandux ikun akbar minn 1/ 3 tal- piż molekulari tal- proteina fil- mira. Jekk il-piż molekulari tal-proteina fil-mira huwa ta' madwar 10 kd, jista' jintuża tubu ta' ultrafiltrazzjoni b'piż molekulari miżmum ta' 3 KD.
2. L-ultrafiltrazzjoni mixtrija reċentement hija niexfa. Żid l-ilma milliq qabel l-użu. L-ilma jgħaddi kompletament mill-membrana u huwa rkuprat minn qabel f'banju tas-silġ jew friġġ għal ftit minuti. Imbagħad ferra l-ilma biex iżżid is-soluzzjoni tal-proteina. L-ammont ta' soluzzjoni ta' proteina ma għandux jaqbeż il-linja bajda fuq in-naħa ta' fuq tat-tubu tat-test. Operazzjoni faċli. Qabel ma żżid is-soluzzjoni tal-proteina, it-tubu tal-ultrafiltrazzjoni jeħtieġ li jiddaħħal fis-silġ għat-tkessiħ minn qabel.
3. Bilanċ. Il-massa u ċ-ċentru tal-gravità għandhom ikunu bbilanċjati. Innota li l-veloċità u l-aċċelerazzjoni m'għandhomx ikunu veloċi wisq, inkella l-membrana tal-ultrafiltrazzjoni tkun bil-ħsara diretta. Ibda l-ultrafiltrazzjoni ċentrifugali (precooling iċ-ċentrifugazzjoni għal 4 gradi). Id-direzzjoni tad-dijaframma u x-xaft li jdur tista' tiġi aġġustata skont l-istruzzjonijiet (fil-każ taċ-ċentrifugazzjoni tal-angolu, id-dijaframma hija perpendikulari max-xaft). Fl-użu attwali, il-veloċità ġenerali hija inqas minn dik speċifikata fil-manwal, li tista' ttawwal il-ħajja tas-servizz tal-pajp ċentrifugali.
4. meta ikkonċentrat mal-1ml li jifdal, [ħu s-soluzzjoni ta ' 50ul dar Bradford, żid 10ul fluwidu biex tara jekk isir blu, u jiddeterminaw jekk it-tubu ultrafiltrazzjoni jnixxi l-proteina. Jekk it-tubu jnixxi, ferragħh fis-saff ta 'fuq u mbagħad erfa' lura għat-tubu l-ġdid biex tibda l-ultrafiltrazzjoni. Biex tiddetermina b'mod preċiż jekk it-tubu tat-test joħroġx, jekk jogħġbok 5mg 10min ċentrifuga 10min, imbagħad għaddih, mexxi l-ġell tal-proteina jew Bradford] [kejl oħxon]. Kompli żid is-soluzzjoni tal-proteina li jifdal biex tikkonċentra (taħdem fuq is-silġ biex tevita t-tisħin tal-proteini) sakemm jiżdiedu s-soluzzjonijiet ikkonċentrati kollha. Matul iċ-ċentrifugazzjoni, oqgħod attent jekk il-preċipitazzjoni tal-proteina sseħħx u tikkawża imblukkar tat-tubi. Jekk isseħħ preċipitazzjoni, jekk jogħġbok iddetermina l-kawża speċifika ta' preċipitazzjoni, jekk il-konċentrazzjoni ta' proteina hijiex għolja wisq jew jekk il-buffer huwiex xieraq; Tal-ewwel jistgħu jiġu solvuti bl-użu ta 'tubi multipli ta' ultrafiltrazzjoni fl-istess ħin biex titnaqqas il-konċentrazzjoni, filwaqt li dawn tal-aħħar jistgħu jibdlu buffers differenti sakemm il-proteina tippreċipita.
5. Il-passi ta 'qabel jintużaw biex jikkonċentraw il-proteina. Jekk il-buffer għandu jiġi sostitwit, meta s-soluzzjoni totali tal-proteina tkun ikkonċentrata għal madwar 1ml, żid bil-mod buffer ġdid (ultrafiltrazzjoni permezz ta' membrana ta' ultrafiltrazzjoni ta' 0.22um), u mbagħad tikkonċentra kontinwament għal madwar 1ml għal tliet darbiet, sabiex il-konċentrazzjoni finali tiddependi fuq il-konċentrazzjoni meħtieġa tal-proteina, li ġeneralment ma tkunx aktar minn 500ul jew inqas minn 200ul. Skont il-konċentrazzjoni tal-volum ta' mill-inqas 10 darbiet kull darba, huwa aktar minn 1000 darba dak ta' tliet darbiet, li bażikament jista' jikseb l-iskop li jinbidel il-buffer.
6. Neħħi l-konċentrat tal-proteina finali. Ħaddem fuq is-silġ. Bl- użu ta ' ponta tal- pipetta safra (200ul), daħħal bil- mod il- ponta tal- pipetta tul it- tarf, imbagħad jonfoħ bil- mod u ħallat is- soluzzjoni tal- proteina. Oqgħod attent li ma tmissx il-membrana tal-ultrafiltrazzjoni. Irdigħ is-soluzzjoni kkonċentrata għal 200ul kull darba sakemm jinġibed kompletament. Mhuwiex meħtieġ li tiġi estratta l-aħħar soluzzjoni kkonċentrata fil-qiegħ tat-tubu tat-test, inkella jkun diffiċli wisq u l-membrana tal-ultrafiltrazzjoni tista' ssirilha ħsara. Fl-aħħarnett, l-ilma milliq jiżdied mat-tubu tal-ultrafiltrazzjoni mingħajr ma jgħaddi mill-membrana tal-ultrafiltrazzjoni biex jipprevjeni t-telf u t-tnixxif tal-ilma tal-membrana.
7. Dawn li ġejjin huma t-turġien għat-trattament tat-tubu tal-ultrafiltrazzjoni u l-użu mill-ġdid tat-tubu tal-ultrafiltrazzjoni.
8. Ferra l-ilma fit-tubu tal-ultrafiltrazzjoni u laħlaħ bil-mod bl-ilma tal-milliq għal diversi drabi. [jekk hemm preċipitazzjoni ovvja tal-proteina fil-qiegħ tat-tubu tat-test, tista 'żżid l-ilma l-ewwel u mbagħad jonfoħha b'pipetta. Oqgħod attent li ma tmissx il-membrana. Is-sediment jiddendel 'l isfel u mbagħad jaħrab. Ma tistax tifflaxxjaha bl-ilma tal-vit. Wara li żżid soluzzjoni 0.2m NaOH, poġġiha f'temperatura tal-kamra għal 20 minuta, u ibbilanċja t-tubu tal-ultrafiltrazzjoni matul dan il-perjodu. Iċċentrifuga għal 10 minuti oħra. Ferra' s-soluzzjoni NaOH li jifdal u għaddas il-qalba tal-qoton fl-ilma tal-beaker (1 jew 2L) Milliq, imqiegħed għal diversi sigħat, u mbagħad sostitwit b'ilma ġdid, imqiegħed għal diversi sigħat biex kontinwament jiddilwa l-konċentrazzjoni ta' NaOH. Aħsel it-tubu tat-test ta '50ml u għatti b'ilma tal-vit, u aħsel il-ħajt ta' ġewwa b'ilma milliq.
9. Oħroġ il-qalba tat-tubu tat-test mgħaddas, żidu mal-ilma sħiħ tal-milliq, u mbagħad imla t-tubu tat-test ta '50ml b'ilma milliq. Bil-mod poġġi l-qalba tat-tubu f'50ml.
Iċċentrifuga t-tubu, ixxotta u aqsam l-ilma, imbagħad għatti u aħżen f'4 gradi sal-użu li jmiss. Ġeneralment, skond il-passi u l-prekawzjonijiet ta 'hawn fuq, kull tubu ma jinkisirx fi żmien tliet jew erba' snin.