Share Letteratura|Tgħid addiju għal purifikazzjoni kumplessa? Metodu ġdid TFF + Surfactant itejjeb l-effiċjenza u jnaqqas l-ispejjeż fil-produzzjoni tal-vettur AAV

It-terapija tal-ġeni qed tiżviluppa malajr, iżda l-ispiża għolja tagħha tibqa 'barriera kbira li tipprevjeni aċċess usa' tal-pazjent. Fost is-sewwieqa ewlenin ta 'din l-ispiża hemm il-proċess ta' produzzjoni kumpless ta 'vettori ta' Virus assoċjati Adeno- assoċjati. Studju ppubblikat fil-bijoteknoloġija u l-bijo-inġinerija żviluppa metodu ġdid ta 'purifikazzjoni li jikkombina filtrazzjoni tal-fluss tanġenzjali (TFF) ma' surfactants, li jwiegħed li jissimplifika l-proċess ta 'purifikazzjoni AAV u jnaqqas l-ispejjeż. Ejja nidħlu f'din ir-riċerka mmexxija minn tim mill-Università ta 'Tokyo.

 

1. Sfond ta 'Riċerka: Sfidi u Status attwali ta' Purifikazzjoni AAV

Il-vettori AAV saru għodod ta 'kunsinna "stilla" fit-terapija tal-ġeni minħabba s-sigurtà għolja tagħhom, immunogeniċità baxxa, il-ħila li jinfettaw kemm diviżjoni kif ukoll ċelloli diviżorji mhux -, u kapaċità għal espressjoni tal-ġeni fit-tul -. Madankollu, il-proċess ta 'produzzjoni tagħhom huwa kumpless, partikolarment il-passi ta' purifikazzjoni 'l isfel, li tipikament jinvolvu rawnds multipli ta' ċentrifugazzjoni u kromatografija. Dawn il-metodi huma l-ħin - li jikkonsmaw, ix-xogħol - intensivi, diffiċli biex jiġu skalati, u għaljin.

Fuq skala tal-laboratorju, il-purifikazzjoni ħafna drabi tiddependi fuq l-ultracentrifugation tal-gradjent tad-densità taċ-ċesju jew tal-iodixanol, li hija ta 'sfida għall-iskala għall-produzzjoni industrijali. Il-kromatografija ta 'l-affinità qed tintuża dejjem aktar, iżda l-kundizzjonijiet baxxi ta' elużjoni ta 'pH li jeħtieġu jistgħu jfixklu l-infettività virali. Għalhekk, l-iżvilupp ta 'metodu ta' purifikazzjoni AAV sempliċi, effiċjenti, ġentili u skalabbli huwa kritiku.

Filtrazzjoni tal-fluss tanġenzjali (TFF) hija daqs - teknika ta 'separazzjoni bbażata komunement użata għall-konċentrazzjoni u l-buffer - skambju ta' bijoprodotti. Madankollu, TFF konvenzjonali għandu kapaċità limitata li jneħħi l-impuritajiet bħal proteini taċ-ċelluli ospitanti (HCPs) u DNA waqt il-purifikazzjoni AAV, ħafna drabi jħalli l-aggregati tal-proteini warajhom.

 

2. Approċċ innovattiv: TFF flimkien ma 'surfactants għal purifikazzjoni effiċjenti

Biex tingħeleb il-limitazzjonijiet tat-TFF tradizzjonali, ir-riċerkaturi Rimi Miyaoka, Yuji Tsunekawa, u l-kollegi fl-Università ta 'Tokyo fasslu strateġija għaqlija: l-użu ta' surfactants biex jinibixxu l-aggregazzjoni u l-interazzjoni ta 'proteini ta' impurità, li jippermettulhom jgħaddu mill-ultrafiltrazzjoni tat-TFF (500 kda (~ 25 nm fid-daqs).

Huma ttestjaw tliet tipi ta 'surfactants:

• Mhux - Ionic:Octyl glucoside
• Anjoniku:Deoxycholate tas-sodju
• Zwitterionic:Chaps

L-istudju sab li l-użu ta 'surfactant joniku mhux {}} waħdu ma kienx effettiv. Kemm id-deoxycholate tas-sodju anjoniku kif ukoll il-chaps zwitterionic tejbu b'mod sinifikanti t-tneħħija ta 'proteini residwi, u huma mmirati għal popolazzjonijiet ta' proteini differenti. Fl-aħħar mill-aħħar, li tgħaqqad 0.5% sodju deoxycholate ma '1% chaps ipproduċiet riżultati notevoli, kważi eliminaw kompletament il-proteini ospitanti residwi. L-analiżi tal-paġna SDS - wriet biss it-tliet faxex ċari tal-proteina tal-kapsid AAV (VP1 / VP2 / VP3).

 

Figura 1. Proċess ta 'purifikazzjoni tat-TFF mingħajr surfactants;(a) SDS - Elettroforeżi tal-Ġel tal-Paġna; (b) Mikroskopija elettronika tat-trasmissjoni (TEM)

 

Figura 1. Proċess ta 'purifikazzjoni tat-TFF ma' surfactants;(a) SDS - Elettroforeżi tal-Ġel tal-Paġna; (b) Mikroskopija Elettronika tat-Trasmissjoni (TEM)

 

3. Riżultati ta 'riċerka: purità għolja, attività, u sigurtà

1. Tneħħija tal-impurità effiċjenti:Il-metodu l-ġdid kiseb 99.98% tneħħija ta 'HCPs u 95% tneħħija ta' DNA, b'purità komparabbli ma 'jew li taqbeż dik tal-kromatografija ta' affinità.
2. Infettività mtejba:Esperimenti in vitro wrew li l-vettori AAV1 ippurifikati bl-użu ta 'dan il-metodu infettat ċelloli HEK293 b'mod aktar effiċjenti minn dawk ippurifikati bil-kromatografija ta' affinità (24.9% vs 20.8%), li jindika preservazzjoni aħjar ta 'bijoattività virali.
3. Sigurtà tajba in vivo:Wara l-injezzjoni lokali ta 'vettori AAV1 purifikati fil-muskolu skeletriku tal-ġurdien, ma ġiet osservata l-ebda infjammazzjoni sinifikanti jew ħsara fit-tessut wara ġimgħatejn, li turi sigurtà tajba in vivo.
4. Applikabilità wiesgħa tas-serotip:Il-metodu ppurifika b'suċċess serotipi multipli - inklużi s-supernatanti AAV1, AAV5, AAV8, u AAV9-From Cell Culture. Madankollu, għal AAV2, li teżisti prinċipalment fil-lisati taċ-ċelluli b'tagħbija għolja ta 'impurità, hija meħtieġa aktar ottimizzazzjoni.

 

4. Sommarju u Outlook

Dan l-istudju żviluppa proċess sempliċi, mgħaġġel (1.5 sigħat), effiċjenti u skalabbli ġdid ta 'purifikazzjoni AAV. Billi tgħaqqad deoxycholate tas-sodju u chaps, hija indirizzat b'suċċess l-isfida ta 'aggregazzjoni ta' proteina residwa waqt il-purifikazzjoni tat-TFF.

Vantaġġi tal-metodu jinkludu:

• Tevita kundizzjonijiet ħorox baxxi ta 'pH, tippreserva aħjar attività virali
• Tnaqqas il-passi tal-kromatografija, tissimplifika l-fluss tax-xogħol, u tiffranka l-ħin u l-ispejjeż
• Faċilment skalabbli, adattat għall-produzzjoni tal-iskala kbira -}
• Provvista ta 'strateġija ġdida għall-purifikazzjoni ta' bijomakromolekuli oħra bħal eżosomi, viruses oħra, u antikorpi rikombinanti

Il-limitazzjonijiet kurrenti jinkludu l-irkupru virali mhux ottimali u l-inkapaċità li jisseparaw il-kapsidi vojta minn partiċelli virali sħaħ, li jissuġġerixxu l-aħjar użu tiegħu jista 'jkun bħala l-ewwel - qbid tal-pass fil-fluss tax-xogħol multi -.

Bħala konklużjoni, din ir-riċerka toffri għażla ġdida attraenti għall-produzzjoni tal-vettur AAV 'l isfel u għandha l-potenzjal li tnaqqas b'mod sinifikanti l-ispiża tal-mediċini tat-terapija tal-ġeni, li tiffaċilita l-applikazzjoni usa' tagħhom.