Sommarju:

Dan l-artikolu jirrevedi żewġ fatturi ewlenin li għandhom jiġu kkunsidrati fl-istrateġiji ta 'purifikazzjoni tal-proteina: rekwiżiti ta' applikazzjoni 'l isfel u l-karatteristiċi bijoloġiċi tal-proteini nfushom. L-artikolu jenfasizza li l-purifikazzjoni tal-proteina ta 'kwalità għolja hija l-pedament għall-affidabbiltà u r-ripetibilità ta' dejta sperimentali, speċjalment għall-produzzjoni ta 'proteini rikombinanti. Xenarji ta 'applikazzjoni differenti għandhom rekwiżiti speċifiċi għall-purità tal-proteini, l-attività jew il-kontenut ta' endotossina, u l-karatteristiċi tal-proteini jistgħu jaffettwaw b'mod sinifikanti l-istrateġiji ta 'purifikazzjoni. Skond każijiet speċifiċi, l-artikolu juri li proteini uniċi għandhom jadottaw skemi ta 'purifikazzjoni personalizzati. Fl-aħħarnett, ġie propost proċess sistematiku ta 'produzzjoni ta' proteina (Figura 1), li jenfasizza l-kontroll tal-kwalità ta 'proċess sħiħ mill-għażla ta' sistemi ta 'espressjoni, disinn ta' kostruzzjoni għall-ottimizzazzjoni ta 'purifikazzjoni, u li jirrakkomanda l-evalwazzjoni ta' omoġenjità u funzjonalità ta 'proteina permezz ta' tekniki bijofiżiċi (bħalma huma sec-MALS, DSF, eċċ.). Dan l-artikolu għandu l-għan li jipprovdi gwida prattika għar-riċerkaturi, u jgħinhom jifformulaw strateġiji ta 'purifikazzjoni effiċjenti u ripetibbli bbażati fuq il-karatteristiċi u r-rekwiżiti ta' applikazzjoni ta 'proteini fil-mira, u b'hekk itejbu l-kwalità u l-effiċjenza tar-riċerka xjentifika.

 

Figura 1. Dijagramma skematika tal-proċess tal-produzzjoni tal-proteini

 

Produzzjoni ta 'proteina għolja ta' domanda - Eżempji ta 'identifikazzjoni tal-problema, disinn ta' strateġija ta 'mitigazzjoni u produzzjoni korrispondenti

 

1. aċidu nukleiku li jorbot mal-proteina:

Meta tippurifika proteini li jorbtu l-aċidu nuklejku, huma meħtieġa passi multipli biex titneħħa l-kontaminazzjoni tal-aċidu nuklejku. Matul il-lisi, in-nucleases (bħal Nuclease SM (Benzonase®) jew DNase jew RNase) jeħtieġ li jiġu miżjuda, iżda l-aċidi nuklejiċi marbuta ma jistgħux jitneħħew kompletament. Ibdel il-passi ta 'tneħħija ta' aċidu nuklejiku, bħal PEI jew streptomycin sulfate preċipitazzjoni, purifikazzjoni ta 'heparin jew kromatografija ta' skambju ta 'joni. Il-preżenza ta 'aċidi nuklejiċi ġiet immonitorjata mill-proporzjon ta' A26 0 NM / A28 0 NM matul il-proċess ta 'purifikazzjoni. Jekk il-proporzjon kien inqas minn 0.6, huwa indika li l-purità tal-proteina kienet relattivament għolja u l-kontaminazzjoni tal-aċidu nuklejku kienet minima. Għal proteini b'aċidi nuklejiċi marbuta sew, jistgħu jiġu żnaturati temporanjament (bħalma huma ttrattati bl-urea) u mbagħad mill-ġdid mill-ġdid. Punti ewlenin: Uża reaġenti ta 'kwalità għolja, buffers friski u kolonni nodfa (nadif b'0.5M NaOH qabel l-użu).

 

2. Katina tqila tal-ferritin tal-ġurdien:

L-iskop tal-produzzjoni tal-proteina tqila tal-ferritin tal-ġurdien tal-ġurdien (MFTH1) hija mikroskopija krio-elettronika b'riżoluzzjoni għolja b'riżoluzzjoni għolja (Cryo-EM). Il-vettur ta 'espressjoni ta' Escherichia coli kkodifikat MFTH1 mhux ikkontestat ġie mfixkel b'mod ultrasonikament mingħajr ma żied l-ebda nuclease. Wara li ssaħħan fi 7 0 grad, għadda minn preċipitazzjoni tas-sulfat tal-ammonju, id-dijalisi u l-passi tal-kromatografija ta 'esklużjoni tad-daqs. Il-kampjun li jirriżulta wera l-preżenza ta 'ammont kbir ta' kontaminanti f'immaġini ta 'mikroskopija krio-elettronika (Figura 2A), li ma kienx kompletament tajjeb għall-applikazzjoni tiegħu. Ottimizza l-passi. Żid Nuclease SM matul il-proċess tal-lisi taċ-ċellula u l-proċess tad-dijalisi wara l-preċipitazzjoni tas-sulfat tal-ammonju, u mbagħad żid il-pass tal-kromatografija tal-iskambju tal-anjoni biex tnaqqas il-proporzjon ta 'A26 0} NM / A280NM minn 1.4 sa 0.8. Wara l-kromatografija ta 'esklużjoni tad-daqs, il-proporzjon ta' A260NM / A280NM tal-kampjun MFTH1 finali kien ta '0.56. L-immaġini ta 'mikroskopija SDS-PAGE u cryo-elettroni (Figura 2B) urew li l-proteina kienet pura ħafna, u tindika li l-kontaminanti tneħħew b'mod effettiv.

Figura 2 katina tqila tal-ferritin tal-ġurdien

 

 

 

3

DSRBEC huwa ffurmat mill-fużjoni tad-dominju li jorbot RNA b'żewġ linji (DSRBD) tal-proteina kinażi R u l-fattur ta 'tkabbir epidermiku tal-bniedem (HEGF). Meta DSRBD huwa espress f'Escherichia coli, juri abilità li torbot dsRNA estremament għolja. Wara l-lisi taċ-ċellula, l-RNA kontainċenti se jfixkel it-twaħħil ta 'proteini rikombinanti mal-kolonna tal-kromatografija ta' affinità tal-joni tal-metall fissa (IMAC). Metodi konvenzjonali bħal PEI jew streptomycin sulfate preċipitazzjoni, trattament RNase jew soluzzjonijiet ta 'buffer ta' melħ għoli ma jistgħux jitneħħew l-RNA. Il-lisi taċ-ċelloli saret bl-użu ta 'buffer li fih 4M urea. Is-supernatant kien mgħobbi fuq kolonna iMac, u 4m sa 0 m urea intuża bil-mod matul il-lejl (rinaturazzjoni tal-kolonna). Il-buffer mill-ġdid ġie miżjud ma 'imidazole u eluż mill-kolonna iMac. L-irfinar finali sar permezz ta 'filtrazzjoni tal-ġel Superdex 75 biex tinkiseb DSRBEC funzjonalment attiv.

 

4. Proteini marbuta ma 'katjoni divalenti jew kofatturi oħra:

Għal proteini li jinteraġixxu ma 'katjoni divalenti bħal Zn 2+, fe 2+, cu 2+, jew kofatturi oħra, huwa kruċjali li żżid katjoni divalenti speċifiċi (jew kofatturi oħra) waqt l-espressjoni. Ammont żgħir tal-istess katjoni divalenti (jew kofatturi oħra) huwa meħtieġ ukoll matul il-proċess ta 'purifikazzjoni. Madankollu, l-użu ta 'kwalunkwe aġenti li jwaqqfu (bħal EDTA, EGTA) u aġenti li jnaqqsu ċ-ċelanti (bħal DTT jew DTE) għandhom jiġu evitati. Meta jiġu ttrattati proteini marbuta ma 'katjoni divalenti, taħlita ta' inibituri ta 'protease mingħajr aġenti ta' ċelanti għandha tintuża biex tikkonferma l-preżenza attwali ta 'katjoni divalenti (jew kofatturi oħra) fil-proteina purifikata permezz ta' metodi spettroskopiċi (bħal spettrofotometrija ta 'assorbiment atomiku).

 

5. Ferridoxin rikombinanti (RFD) li fih cluster wieħed [2Fe ± 2S] minn cyanobacteria termofiliċi mastigocladus laminosus

Ferridoxin hija proteina li tinħall tal-kubrit tal-ħadid li tipparteċipa f'reazzjonijiet ta 'trasferiment ta' elettroni. Ferroredoxin tat-tip tal-pjanti jġorr raggruppament wieħed [2Fe ± 2S] bħala aċċettatur tal-elettroni tal-fotosistema I. Ir-razza Escherichia coli BL21 (DE3) esprimiet il-proteina RFD rikombinanti fil-mezz TB li fih 10mm FECL3 u antibijotiċi. L-elużjoni tal-kolonna tal-qbid iMac saret bl-użu ta 'buffer li fih 10mm istidina biex tevita imidazole u tevita l-qerda tal-cluster [2FE ± 2S]. Il-kromatografija ta 'skambju ta' anjoni u esklużjoni tad-daqs intużaw għal aktar purifikazzjoni u konċentrazzjoni għal 12mg / mL għall-iscreening tal-kristallizzazzjoni. Meta mqabbel mal-produzzjoni rikombinanti ta 'ferroredoxin, il-ferroredoxin naturali ppurifikat mill-alka blu-aħdar mastigocladus laminosus kiseb riżoluzzjoni ogħla waqt il-kristallizzazzjoni.

 

6. Proteini użati bħala antiġeni

Il-proteini spiss jintużaw bħala antiġeni biex jirkupraw ligands speċifiċi għall-mira. L-ewwel ħaġa li għandek tikkonsidra hija jekk il-proteina tintużax għall-immunità in vivo biex tinkiseb IgG monoklonali jew poliklonali konvenzjonali, jew għal programmi li jinvolvu IgG ġemel jew proċessi ta 'għażla in vitro.

 

6.1 antiġeni użati għall-produzzjoni ta 'antikorpi ta' rutina

Meta l-antiġeni jintużaw biex jipproduċu antikorpi monoklonali IgG, it-tiwi korrett ta 'l-antiġen ġeneralment ma jkunx meħtieġ, minħabba li ħafna antikorpi monoklonali jirrikonoxxu epitopi lineari li mhumiex affettwati ħafna mill-istruttura ta' l-antiġen, u anke antiġeni żnaturati (bħal proteini tal-korp ta 'inklużjoni) jibqgħu effettivi. Madankollu, il-purità għandha tkun ikkontrollata strettament biex tevita kontaminanti immunogeniċi qawwija li jinterferixxu mar-rispons immuni u jikkawżaw id-dominanza ta 'antikorpi mhux fil-mira.

 

6.2 Screening tal-Librerija Konjugata

Għandha tingħata attenzjoni speċjali għaż-żamma tal-konformazzjoni naturali tal-antiġen waqt l-ipproċessar tal-librerija tan-nanobody miksuba bl-immunizzazzjoni tal-ġemel. B'differenza mill-antikorpi konvenzjonali, l-antikorpi tal-ġemel (speċjalment in-nanobodi) għandhom it-tendenza li jirrikonoxxu l-epitopi strutturali, li hija relatata mal-istruttura tas-sit komplementari unika tagħhom. Bl-istess mod, meta jiġu skrinjati libreriji ta 'antikorpi sintetiċi jew naturali kbar in vitro, l-antiġen għandu jżomm struttura li hija kompletament konsistenti mal-applikazzjoni fil-mira. Peress li l-proċess ta 'skrining innifsu mhuwiex preġudikat, jekk l-antiġen ikollu l-isfond ħażin, l-aggregazzjoni jew l-eteroġeneità konformazzjonali, numru kbir ta' konjugati mmirati lejn epitopi mhux naturali jistgħu jiġu skrinjati.

 

 

 

7. Proteini li fihom bonds disulfide intermolekulari jew intramolekulari jew ċisteina ħielsa

Il-bonds disulfide huma kruċjali għall-istabbilizzazzjoni tal-istruttura naturali tal-proteini. Matul il-proċess ta 'purifikazzjoni, meta tippurifika l-proteini li jkun fihom bonds intermolekulari jew intramolekulari disulfide, huwa meħtieġ li jiġu evitati li jiżdiedu aġenti li jnaqqsu biex jipprevjenu bidliet konformazzjonali tal-proteini, u b'hekk jibdlu l-funzjonijiet tagħhom. Għal proteini li fihom ċisteina ħielsa, l-aġenti li jnaqqsu huma indispensabbli fil-passi kollha tal-proċess ta 'purifikazzjoni, speċjalment waqt il-ħażna, biex jipprevjenu l-formazzjoni ta' bonds disulfide artifiċjali. L-aġenti li jnaqqsu l-aktar użati huma dithiothreitol (DTT), -Mercaptoethanol (-me), u Tris ({2- carboxyethyl) fosfina hydrochloride (TCEP). Għal raża iMAC li mhumiex kompatibbli mad-DTT jew TCEP, huwa rrakkomandat li tuża -ME u tibdilhom ma 'aġenti oħra li jnaqqsu fil-passi sussegwenti.

 

8. Framment ta 'antikorpi rikombinanti

Għalkemm l-istruttura ta 'frammenti ta' antikorpi rikombinanti (bħal nanobodi) hija aktar sempliċi minn dik ta 'IgG, il-funzjoni tagħhom tiddependi fuq il-formazzjoni korretta ta' bonds disulfide. Fis-sistemi ta 'espressjoni batterika, anke bl-adozzjoni ta' strateġiji ta 'ottimizzazzjoni, jistgħu jkunu għadhom iseħħu prodotti mitwija jew parzjalment mitwija, li jeżistu kemm fil-parti li tinħall kif ukoll fil-korp ta' l-inklużjoni. Aktar moħbi huwa li anke frammenti ta 'antikorpi mitwija b'mod korrett jistgħu jiffurmaw aggregati li jinħallu (aggregazzjoni kollojde) permezz ta' plakki idrofobiċi fuq il-wiċċ. Dawn l-aggregati huma diffiċli biex jiġu identifikati fit-testijiet funzjonali ta 'rutina (bħal ELISA) minħabba li t-twaħħil multivalenti jista' jaħbi t-tnaqqis fl-affinità tal-monomeru, iżda l-preżenza tagħhom tista 'taffettwa serjament l-applikazzjonijiet li jiddependu fuq id-daqs żgħir tal-molekula (bħal mikroskopija super-riżoluzzjoni). Għalhekk, li sserraħ biss fuq SDS-PAGE mhix biżżejjed biex tevalwa l-kwalità tal-kampjun. Metodi bijofiżiċi bħall-filtrazzjoni tal-ġel (Figura 3) għandhom jiġu adottati biex jiddistingwu monomeri (qċaċet ewlenin) mill-aggregati (qċaċet tal-volum ta 'esklużjoni). Il-punti ta 'kontroll ewlenin jinkludu: L-ottimizzazzjoni tal-ambjent redox waqt l-espressjoni biex tippromwovi l-formazzjoni ta' bonds disulfide, u l-ottimizzazzjoni ta 'kundizzjonijiet ta' ħażna wara purifikazzjoni biex tevita l-aggregazzjoni. Dawn il-miżuri huma kruċjali biex tiġi żgurata l-monodispersità u l-funzjoni tal-frammenti tal-antikorpi.

Figura 3. Separazzjoni tal-filtrazzjoni tal-ġel ta 'aggregati li jinħallu ta' nanobodi

 

9. Fragmenti li jinħallu tar-riċettur tal-limfoċiti llt1

Espressjoni rikombinanti ta 'proteini li jiddependu mill-bond disulfide (bħal riċettur tal-limfoċiti LLT1) ħafna drabi tiffaċċja diffikultajiet li jintwew. Il-filtrazzjoni tal-ġel ta 'LLT1 tat-tip selvaġġ wriet qċaċet ta' aggregazzjoni u qċaċet tad-dimer (Figura 4A), iżda l-ispettrometrija tal-massa żvelat it-tarf ħażin ikkawżat minn ċisteina mhux imqabbla fid-dimer (Figura 4B). Għal dan il-għan, żewġ mutanti ġew iddisinjati: wieħed neħħa l-problema taċ-ċisteina, li rriżultat fi waqgħa f'daqqa fir-rendiment (Figura 4A); Wara l-introduzzjoni ta 'neokisteina biex terġa' tinbena l-bond disulfide konformi, il-mutant mhux biss kellu rendiment għoli u stabbiltà tajba, iżda wkoll jista 'jikkristallizza (Figura 4C), u l-istruttura 3D ikkonfermat li l-mutant ifforma l-bond disulfide korrett u żamm it-tiwi naturali. Dan il-każ juri li bit-tfassil b'mod razzjonali ta 'bonds ta' disulfide konformali, flimkien ma 'filtrazzjoni tal-ġel u analiżi tal-ispettrometrija tal-massa, il-problema li tiwi ta' proteini rikombinanti tista 'tissolva b'mod effettiv, u proteini funzjonali bi strutturi stabbli u rendimenti għoljin jistgħu jinkisbu.

Figura 4. Ir-rikostruzzjoni tal-bond disulfide ttejjeb it-tiwi u r-rendiment ta 'LLT1 li jinħall

 

 

 

10. Proteini faċilment aggregabbli

Il-purifikazzjoni ta 'proteini rikombinanti ħafna drabi tiffaċċja l-problema ta' aggregazzjoni, u l-formazzjoni tagħha ssegwi l-mekkaniżmu ta '"tkabbir tan-nukleazzjoni" - ammont żgħir ta' aggregati li jinħallu jiffurmaw l-ewwel u mbagħad jikkawżaw aggregazzjoni li ma tinħallx fuq skala kbira. Biex tindirizza din l-isfida, hemm bżonn li jiġu adottati strateġiji fuq ħafna livelli: fl-istadju tal-espressjoni, dan jista 'jinkiseb billi tiġi ottimizzata r-razza, tnaqqas it-temperatura tal-kultura, bl-użu ta' medja ta 'kultura modifikata jew proteini ta' fużjoni solubilizzanti differenti, u li tissostitwixxi sistemi ta 'espressjoni (ċelloli ta' insetti / mammiferi), eċċ ta 'iMac għal Sec) għandhom jiġu adottati biex jitneħħew fil-pront in-nuklei aggregati. B'mod ġenerali, meta jiġu skrining soluzzjonijiet buffer, fatturi bħall-kompożizzjoni tal-komponenti, il-valur tal-pH, l-aġent tad-dissoċjazzjoni jew is-solubilizzatur għandhom jiġu kkunsidrati (Figura 5). Permezz ta 'ottimizzazzjoni fina ta' skoperta ortogonali (bħal SEC, CD, LS, DSF u bidla fit-temperatura bbażata fuq sħana tal-fluworexxenza, eċċ.), Il-kwalità tal-proteina u l-iktar soluzzjoni buffer xierqa ġew iddeterminati.

Figura 5. Strateġiji biex tittaffa l-aggregazzjoni tal-proteini

 

11. Kristallizzazzjoni tal-Kinase CLK1 tal-Bniedem (kif tikseb lottijiet riproduċibbli)

Sabiex tinkiseb Clk1 kinase omoġenja mhux fosforilata għal studji ta 'kristallizzazzjoni, ġiet adottata skema ta' kollaborazzjoni b'ħafna strateġija. L-ewwelnett, kien ko-espress ma 'λ -fosfatase f'Escherichia coli biex telimina l-eteroġeneità ta' l-awtofosforilazzjoni. Għalkemm ir-rendiment tnaqqas, ġiet assigurata defosforilazzjoni kompluta. Wara l-qbid mill-iMac, l-eluent ġie ssupplimentat bi stabbilizzaturi (50mm arginine, 50mm aċidu glutamiku u 10mm DTT) biex tevita l-aggregazzjoni, ikkonċentrata, u t-tikketta tiegħu tneħħiet bid-diġestjoni TEV. Imbagħad, l-oligomer korrett ġie separat minn SEC (li fih 5% gliċerol u -me). L-aħħar pass kruċjali ta 'skambju ta' anjoni jiddistingwi bejn gruppi kristallini (mhux fosforilati) u dawk mhux kristallini (parzjalment fosforilati) CLK1. Ta 'min jinnota b'mod partikolari li l-mod ta' lisi taċ-ċellula jaffettwa b'mod sinifikanti l-istabbiltà tal-proteina - il-metodu ta 'pressjoni għolja u ta' temperatura għolja jwassal għal aggregazzjoni irreversibbli ta 'CLK1, li tenfasizza l-importanza ta' trattament ħafif għall-preparazzjoni ta 'kinase.

 

 

 

12. Ipproduċi galectin -1 b'kapaċità stabbli li torbot il-ligand

Biex tħejji galectin funzjonali -1 għal studji li jorbtu ligand, l-espressjoni u l-istrateġiji ta 'purifikazzjoni ta' erba 'kostruzzjonijiet (galectin mhux immarkati u t-tikketta selvaġġa tiegħu -1, mhux imqabbla u ttikkettjati minn Galectin mutanti mingħajr ċisteina -1) kienu mqabbla. Sejbiet ewlenin jindikaw li l-purifikazzjoni tal-kromatografija ta 'l-affinità tal-lactose tista' effettivament tiskrinja għal proteini mitwija b'mod korrett, iżda jeħtieġ li tkun ikkombinata ma 'dijalisi bir-reqqa (buffer HEPES) biex tneħħi kompletament il-lattosju mis-sit li jorbot u tirrestawra l-attività CRD. Galectin tat-tip selvaġġ -1 huwa suxxettibbli għal ossidazzjoni u inattivazzjoni, u l-istabbiltà tagħha tibqa 'limitata anke fil-preżenza ta' aġenti li jnaqqsu (Figura 6). Madankollu, il-mutant ħieles miċ-ċisteina jsaħħaħ b'mod sinifikanti l-istabbiltà fit-tul filwaqt li jżomm attività ta 'agglutinazzjoni komparabbli u stabbiltà termali (ivverifikat minn NANODSF, ITC, eċċ.) Billi telimina d-dipendenza tal-bond disulfide.

Figura 6. Il-karatterizzazzjoni idrodinamika ta 'galectin rikombinanti -1 tiżvela l-instabilità tagħha

 

13. Tneħħija ta 'endotossina

Il-metodu ta 'tneħħija ta' endotoxin huwa bbażat fuq kromatografija ta 'affinità inkluż kromatografija ċċarġjata b'mod pożittiv (skambju ta' anjoni), l-użu ta 'ligands polikazzjoniċi (bħal poly-L-lysine (PLL), polyamine immobilizzat (polimyxin B)), u ż-żieda tat-triton surfactant x -114. Matul il-proċess ta 'purifikazzjoni, oqgħod attent għat-tħejjija tas-soluzzjoni buffer b'ilma ħielsa mill-LPS, u uża kolonni jew kolonni ġodda li ntużaw biss f'purifikazzjonijiet oħra ħielsa mill-LPS. Għal kontaminazzjoni ta 'endotoxin, is-sistema kromatografika tal-pompa / fluwidu tista' tiġi inkubata matul il-lejl f '0. 5M NaOH jew għal 4 sigħat f' 1. {0} m NaOH. L-ammont finali ta 'LPS fil-kampjun ġie evalwat bl-użu ta' Reaġent ta 'Lysate Amebocyte Limulus (LAL), u ġie vverifikat jekk kienx taħt il-limitu meħtieġ għall-applikazzjoni speċifika.

 

14. Kumpless tal-Proteini

L-espressjoni u l-purifikazzjoni tal-kumplessi tal-proteini jeħtieġ li jiġu ottimizzati skont il-kundizzjonijiet speċifiċi. L-isfidi jinkludu l-instabilità jew it-tarf ħażin ta 'subunitajiet. Kull subunità tista 'tiġi espressa b'mod indipendenti u mmuntat in vitro, jew ko-espressa biex tifforma kumplessi ta' proteini funzjonali. Id-disinn tal-kostruzzjoni għandu jiġi introdott bir-reqqa b'tikketti ta 'purifikazzjoni jew skoperta biex jiġu evitati interferiment ma' assemblaġġ, speċjalment meta l-informazzjoni kumplessa hija limitata u huma meħtieġa ottimizzazzjonijiet multipli. Matul il-proċess ta 'purifikazzjoni, l-integrità u l-istabbiltà tal-kumpless jeħtieġ li jiġu evalwati. Il-metodi jinkludu SDS-PAGE (sejbien ta 'subunità), SEC (omoġenjità), SEC-MALS (analiżi tal-massa molari), fotometrija tal-massa jew spettrometrija tal-massa naturali (verifika tal-massa). Għandu jkun innutat li l-kumpless jista 'jiddisassoċja f'konċentrazzjonijiet baxxi. F'dan iż-żmien, il-metodu kromatografiku jew buffer (bħal permezz ta 'kondizzjonijiet ta' skrining termali jew DSF) jeħtieġ li jkun ottimizzat. Barra minn hekk, it-tnaqqis tal-passi ta 'purifikazzjoni jista' jipprevjeni t-telf ta 'subunitajiet ta' interazzjoni dgħajfa u jibbilanċja l-effiċjenza ta 'purifikazzjoni u l-integrità tal-kumpless.

 

 

 

15. Purifikazzjoni ta 'kumplessi ta' antiġen-antikorpi

Kumplessi ta 'antikorpi-antiġeni huma eżempji tipiċi ta' kumplessi ta 'proteini. Il-ko-kristallizzazzjoni tagħhom tista 'tiżvela mudelli li jorbtu u tiggwida l-ottimizzazzjoni ta' inġinerija ta 'antikorpi. Metodi tradizzjonali jeħtieġu purifikazzjoni separata ta 'antiġeni u antikorpi u mbagħad jitħalltu. Madankollu, studji riċenti wrew li l-istrateġiji ta 'ko-espressjoni u ko-purifikazzjoni huma aktar effiċjenti. Purifikazzjoni waħda hija meħtieġa biss biex jinkiseb il-kumpless, u fl-istess ħin, antiġeni instabbli jistgħu jiġu stabbilizzati permezz ta 'antikorpi, u anke espressjoni ħielsa mit-tikketta tista' tinkiseb. F'din is-sitwazzjoni speċifika, SDS-PAGE u filtrazzjoni tal-ġel (SEC) huma ġeneralment biżżejjed biex tevalwa l-purità u l-kwalità tal-kumpless.

 

Sommarju

Il-purifikazzjoni tal-proteina hija teknoloġija fundamentali fir-riċerka xjentifika. Il-produzzjoni ta 'proteina fuq skala akkademika ġeneralment issegwi strateġiji standard u tista' tipproduċi proteini li jinħallu fil-livell għoli ta 'milligramma, li huma użati ħafna fil-bijoloġija strutturali, bijokimika u riċerka funzjonali. Madankollu, ir-rekwiżiti speċjali ta 'applikazzjonijiet downstream (bħall-ħtieġa għal ebda endotossina f'esperimenti fuq l-annimali u l-ebda kontaminazzjoni ta' nuklease fir-riċerka tal-aċidu nuklejiku) jew il-karatteristiċi inerenti tal-proteini (bħal aggregazzjoni faċli, li fihom bonds disulfide jew affinità għolja ta 'aċidu nuklejiku) ħafna drabi jeħtieġu soluzzjonijiet personalizzati. Din ir-reviżjoni, b'reazzjoni għal dawn iċ-ċirkostanzi speċjali, tipproponi strateġiji raffinati li jvarjaw mill-għażla ta 'sistemi ta' espressjoni, id-disinn ta 'kostruzzjonijiet (ottimizzazzjoni ta' tikketti u konfini tad-dominju) għall-proċess ta 'purifikazzjoni, u jintroduċi kontroll tal-kwalità (bħal SEC, SDS-PAGE, skoperta ta' attività, eċċ.) F'passi ewlenin. Xi applikazzjonijiet jirrikjedu wkoll analiżi addizzjonali (bħal skoperta ta 'endotossina u determinazzjoni tar-residwi ta' aċidu nuklejku), simili għall-kunċett "assigurazzjoni tal-kwalità" (QA) fl-industrija bijofarmaċewtika, jiġifieri, biex tevita difetti permezz ta 'proċessi sistematiċi. Billi tifformula linji gwida ta 'kontroll tal-kwalità u tikkjarifika standards speċifiċi għar-reaġenti tal-proteini użati fir-riċerka xjentifika, l-għan huwa li jiġu stabbiliti normi ta' purifikazzjoni tal-proteina aktar rigorużi għal-laboratorji akkademiċi, isaħħu l-affidabbiltà u r-ripetibbiltà tad-dejta sperimentali, u jnaqqsu d-distakk bejn ir-riċerka bażika u l-istandards industrijali.

 

Doi: 10.1186 / s 12934-022-01778-5