Prekawzjonijiet għall-użu ta 'tubu ultrafiltrazzjoni
(1) Agħżel it-tubu tal-ultrafiltrazzjoni xieraq. Ġeneralment, il- piż molekulari li għandu jinżamm m' għandux ikun akbar minn 1/ 3 tal- piż molekulari tal- proteina fil- mira. Pereżempju, jekk il-piż molekulari tal-proteina fil-mira huwa 35kDa, jista 'jintgħażel it-tubu tal-ultrafiltrazzjoni b'piż molekulari ta' 10kDa. Jekk il-piż molekulari tal-proteina fil-mira huwa ta 'madwar 10kd, tubu ta' ultrafiltrazzjoni b'piż molekulari ta '3KD jista' jintuża. Aqra b'attenzjoni l-manwal tal-istruzzjoni u oqgħod attent għat-tolleranza differenti tal-membrana tal-ultrafiltrazzjoni għal diversi kimiċi.
(2) L-ultrafiltrazzjoni mixtrija ġdida hija niexfa. Żid l-ilma ultrapure qabel l-użu, u l-ilma jgħaddi kompletament mill-membrana. Kessaħha minn qabel f'banju tas-silġ jew friġġ għal ftit minuti. Imbagħad ferra l-ilma u żid is-soluzzjoni tal-proteina. L-ammont miżjud ma għandux jaqbeż il-linja bajda fuq in-naħa ta' fuq tat-tubu. L-operazzjoni għandha tkun ħafifa. Qabel ma żżid soluzzjoni ta 'proteina, it-tubu ultrafiltrazzjoni jeħtieġ li jiddaħħal fuq is-silġ għall-precooling.
(3) Bilanċ. Kemm il-massa kif ukoll iċ-ċentru tal-gravità għandhom ikunu bbilanċjati. Innota li l-veloċità u l-aċċelerazzjoni m'għandhomx ikunu veloċi wisq, inkella l-membrana tal-ultrafiltrazzjoni tkun bil-ħsara diretta. Ibda l-ultrafiltrazzjoni ċentrifugali (precooling ċentrifugu għal 4 gradi). Wara li l-RPM ta 'ċentrifugi differenti jiġi kkonvertit fi G, huwa differenti. Aġġusta l-aċċelerazzjoni taċ-ċentrifuga għall-irkaptu l-aktar baxx biex tnaqqas il-pressjoni fuq il-membrana. Innota li trid tistenna sakemm iċ-ċentrifuga tilħaq il-veloċità fil-mira qabel ma titlaq iċ-ċentrifuga, inkella meta jkun hemm problema biċ-ċentrifuga, ma tistax tittrattaha fl-ewwel darba. Id-direzzjoni tal-membrana u x-xaft li jdur għandhom jiġu aġġustati skont l-istruzzjonijiet (fil-każ taċ-ċentrifugazzjoni li ddur fl-angolu, il-membrana hija perpendikulari max-xaft). Fl-użu prattiku, il-veloċità hija ġeneralment aktar baxxa minn dik fil-manwal, li tista 'ttawwal il-ħajja tas-servizz tal-pajp ċentrifugali.
(4) Meta jkun ikkonċentrat għall-1ml li jifdal, ħu 50ul buffer soluzzjoni u żid 10ul biex tgħaddi biex tara jekk issirx blu, sabiex tiġġudika jekk it-tubu ultrafiltrazzjoni jnixxi proteina. Jekk it-tubu jnixxi, ferra s-saff ta 'fuq u għaddi mit-tubu l-ġdid u ibda l-ultrafiltrazzjoni. Biex tiġġudika b'mod preċiż jekk it-tubu hux qed inixxi, iċċentrifuga b'5mgml BSA għal 10min, imbagħad ħu fluss minn, run kolla tal-proteina jew Bradford għal kejl mhux maħdum, u kompli żid is-soluzzjoni tal-proteina li jifdal għall-konċentrazzjoni (joperaw fuq is-silġ biex jipprevjenu li l-proteina tissaħħan) sakemm jiżdiedu s-soluzzjonijiet konċentrati kollha. Oqgħod attent għal jekk il-preċipitazzjoni tal-proteina sseħħx matul iċ-ċentrifugazzjoni, li tirriżulta fi imblukkar tal-pajpijiet. Jekk isseħħ preċipitazzjoni, iddetermina l-kawża speċifika ta' preċipitazzjoni, jekk il-konċentrazzjoni ta' proteina hijiex għolja wisq jew jekk il-buffer ma jkunx xieraq; Tal-ewwel jistgħu jiġu solvuti b'ultrafiltrazzjoni simultanja b'tubi multipli ta 'ultrafiltrazzjoni biex titnaqqas il-konċentrazzjoni. Dan tal-aħħar għandu jibdel soluzzjonijiet ta' lqugħ differenti sakemm il-proteina ma tippreċipikax.
(5) Il-passi ta 'qabel jintużaw biex jikkonċentraw il-proteina. Jekk trid tibdel il-buffer, meta s-soluzzjoni totali tal-proteina tkun ikkonċentrata għal madwar 1ml, żid bil-mod buffer ġdid (ultrafiltrazzjoni permezz ta 'membrana ta' ultrafiltrazzjoni ta '0.22um), u mbagħad ikkonċentra għal madwar 1ml għal tliet darbiet konsekuttivi. Il-volum finali ta' l-aħħar konċentrazzjoni jiddependi fuq il-konċentrazzjoni meħtieġa ta' proteina, li ġeneralment ma tkunx aktar minn 500ul, jew tista' tkun ikkonċentrata għal inqas minn 200ul. Skond il-konċentrazzjoni tal-volum ta 'mill-inqas 10 darbiet kull darba, tista' tilħaq aktar minn 1000 darba tliet darbiet, li bażikament tista 'tikseb l-iskop li tbiddel il-buffer.
