It-Teknoloġija tal-Membrana U Kjarifika tat-Tilqim (Ⅱ)

Fl-artikolu preċedenti, kellna xi introduzzjoni preliminari għal vaċċini u strateġiji ta 'kjarifika tat-tilqim, u se nkomplu nesplorawhom fil-bqija ta' dan l-artikolu. Wara dan ta 'hawn fuq, aħna se nkomplu naqsmu kjarifiki tal-vaċċini u applikazzjonijiet relatati tat-tessut tal-membrana.

 

2.2.2 Influwenza tal-proprjetajiet fiżiċi u kimiċi tal-virus

Wara li tikkunsidra s-sistema ta 'produzzjoni u l-metodi biex jitneħħew il-kontaminanti rilevanti fil-pass ta' kjarifika, huwa importanti li jitqiesu l-karatteristiċi tal-virus u tiffoka fuq il-massimizzazzjoni tar-rendiment tal-virus.

 

2.2.2.1 Adsorbiment faċli tal-virus
Materjali ċċarġjati b'mod pożittiv u għajnuniet għall-filtru (bħal diatomit) ġew żviluppati biex itejbu l-effetti ta 'filtrazzjoni fil-fond. Għalkemm il-ħlas pożittiv iżid il-qbid ta 'aċidi nuklejċi u HCP, id-diatomit huwa magħruf li jorbot id-debris taċ-ċelluli u l-kollojdi. Madankollu, dawn il-materjali jistgħu wkoll iżommu l-virus permezz tal-mekkaniżmu ta 'assorbiment. Peress li l-virus ġeneralment ikun iċċarġjat b'mod negattiv fis-soluzzjoni, jistgħu jseħħu interazzjonijiet elettrostatiċi mal-filtru iċċarġjat b'mod pożittiv.
Il-viruses jistgħu wkoll jorbtu bl-interazzjonijiet idrofobiċi jew mhux speċifiċi tagħhom ma 'ċerti materjali tal-filtri (bħal diatomit jew fibri tal-ħġieġ). Virusijiet enveloped, minħabba l-pakkett tal-lipidi tagħhom, huma aktar suxxettibbli għal dan l-assorbiment. Jekk il-virus jiġi adsorbit mal-filtru permezz ta 'interazzjonijiet elettrostatiċi, u l-partiċelli tal-virus jinqalgħu minħabba l-kompetizzjoni tal-melħ, it-tlaħliħ tal-filtru b'buffer konduttiv ħafna jista' jirkupra parzjalment il-virus. Madankollu, dan jista 'wkoll jeħles kontaminanti bħal HCP jew aċidi nuklejċi. Għalhekk, l-użu ta 'materjal ta' filtru alternattiv, bħall-polipropilene aktar inerti, huwa preferut.
Adenovirus is easily adsorbed, but different results have been confirmed. Using positively charged diatomite and deep filters. Borosilicate glass fiber filter material is also very well recovered. On the other hand, a patent proposed by Weggeman involving clarification of 20 – 40% adenovirus losses at PER, et al. Cell cultures were prepared with similarly positively charged deep filters containing diatomite. In this case, the nominal polypropylene filter showed a very high viral recovery rate (> 90%).
Huwa magħruf sew li l-viruses ta 'l-influwenza huma suxxettibbli għal telf ta' adsorbiment waqt il-kjarifika. Għalhekk, l-użu ta 'filtru bla ħlas, il-filtru bbażat fuq il-polipropilene, huwa adattat biex jiċċara l-ġbir tal-influwenza. Thompson et al irrapportaw l-użu ta 'filtru tal-polypropylene nominali nominali ta' 1.2 μ m segwit minn 0.45 μm membrana PVDF biex jiċċara l-virus tal-influwenza bbażat fuq iċ-ċelluli prodott minn ċelluli MDCK. Total ta 'disa' testijiet ta 'purifikazzjoni saru fuq l-iskala 20L, tagħbija 111 L / m2 għal 1.2 μ m filtru tal-polypropylene u 105 L / m2 għal 0.45 μm filtru PVDF. Ir-riżultati wrew li l-maġġoranza tal-viruses li qed jaħdmu rkupraw tajjeb (78-154%). Huma rrappurtaw ukoll sa 58% ta 'tneħħija ta' hcDNA, iżda l-ebda tneħħija sinifikanti ta 'HCP.

 

2.2.2.2 Qtugħ ta' viruses sensittivi

Xi viruses (inkapsulati jew mhux inkapsulati) juru reżistenza mekkanika baxxa u jistgħu jinqerdu bl-espożizzjoni ta 'shear waqt passi ta' ċentrifugazzjoni u filtrazzjoni tal-membrana. Forzi ta 'shearing iġġenerati waqt passi ta' purifikazzjoni li jinvolvu filtrazzjoni jew kromatografija jistgħu jikkawżaw li l-envelop virali jaqa ', u b'hekk jaffettwaw l-infettività. Skont id-daqs, il-ħxuna u l-ġeometrija tal-kapsid, il-kapsid virali jista 'jkun fraġli jew, bil-maqlub, reżistenti għal pressjonijiet għoljin. Xi viruses enveloped, bħall-viruses tal-influwenza, huma elastiċi għal stress mekkaniku u jistgħu jifilħu deformazzjoni kbira. Min-naħa l-oħra, il-forza ta 'shear tista' tikkawża li l-envelop ta 'viruses inqas reżistenti, bħal retroviruses, jaqa', u b'hekk jaffettwa l-infettività tal-virus.

Il-VLPs tal-pakkett iġġenerat extraċellulari huma wkoll vulnerabbli ħafna. Rati ta 'shear għolja huma ġġenerati fil-proċess ċentrifugali, prinċipalment fil-partijiet tad-dħul u l-ħruġ (rati ta' shear għolja huma ġġenerati fl-interface tal-gass-likwidu). Meta l-virus ġie ppurifikat permezz ta 'ċentrifugazzjoni gradjent, il-kapaċità ta' trasduzzjoni ta 'xi retroviruses kienet imdgħajfa b'mod sinifikanti. Meta tiddisinja s-separazzjoni ċentrifugali, għandha titqies l-instabilità relattiva tal-partiċelli virali għall-forzi ta 'shear. Il-forza ċentrifugali mhix l-uniku sors ta 'xokk ta' shear, aktar importanti huwa d-disinn tat-tagħmir, speċjalment fl-importazzjoni u l-esportazzjoni għandhom ukoll xokk ta 'shear sinifikanti. Differenzi fid-disinn ta 'skali differenti jistgħu jwasslu għal differenzi fir-rendiment u l-irkupru ta' viruses sensittivi għall-shear fuq skali differenti.

Il-viruses sensittivi għat-tqattigħ għandhom ikunu ddisinjati bir-reqqa minħabba li l-kobor tal-istress shear u l-ħin tal-espożizzjoni għall-istress (minħabba r-riċirkolazzjoni) jistgħu jkunu għoljin. Għal viruses sensittivi għall-shear, apparati ta 'ċirkwit miftuħ (fibra vojta jew apparati ta' pjanċa miftuħa) huma preferuti biex inaqqsu t-taqlib u l-forzi ta 'shear fil-kanal tal-għalf.

L-għażla tal-parametri operattivi għandha wkoll timminimizza l-ħsara lill-partiċelli tal-virus: cross flow baxx, pressjoni transmembrana medja (TMP), u ħin qasir ta 'proċessar.

Kontaminazzjoni tal-membrana taħt pressjoni għolja twassal għal telf ta 'infettività virali, possibilment minħabba l-forzi li l-azzjoni ta' shear tista 'taġixxi fuq l-envelop virali. Is-separazzjoni bbażata fuq il-membrana hija bbażata fuq id-daqs, u l-akkumulazzjoni ta 'inibituri virali ta' piż molekulari kbir u partiċelli virali tista 'tnaqqas l-infettività ta' vettori virali.

Id-degradazzjoni ta 'viruses sensittivi għall-shear waqt filtrazzjoni fil-fond mhix dokumentata b'mod wiesa'. It-telf ta 'viruses fil-filtrazzjoni profonda ħafna drabi huwa attribwit għal insib, adsorbiment, jew degradazzjoni virali dipendenti mit-temperatura tal-prodott. Fil-fatt, anki jekk l-istress mekkaniku jista 'jseħħ fis-sistemi NFF, il-ħin ta' espożizzjoni għall-prodotti NFF għat-tqattigħ huwa qasir ħafna meta mqabbel ma 'teknoloġiji oħra minħabba l-pass wieħed rapidu esperjenzat fil-prodotti NFF.

 

2.2.2.3 Interċettazzjoni skont id-daqs tal-apertura

Viruses ta' aktar minn 100 nm jistgħu jinżammu billi jitneħħew mycoplasma jew membrani ta' grad sterili (0.22 μm u inqas). F'dan il-każ, għandha tingħata attenzjoni speċjali lill-għażla tal-filtri. Għal passi TFF ta 'mikrofiltrazzjoni, membrani ta' 0.45μm jew 0.65μm huma preferuti għal kanali ta 'prodotti tajbin. Għall-filtrazzjoni f'diversi stadji NFF, l-aktar saff dens huwa Akbar minn jew ugwali għal 0.45μm. Għandha tingħata attenzjoni meta tagħżel filtru fond, peress li xi apparati tal-filtru fil-fond jista 'jkun fihom saff ta' film, li jista 'jirriżulta f'telf ta' prodott minn drive ta 'żamma. L-aggregazzjoni tal-virus taffettwa b'mod negattiv il-produzzjoni tal-virus u ssaħħaħ iż-żamma tal-virus minħabba d-daqs tal-virus.

Skont privattiva minn Andre u Champluvier, l-omoġenizzazzjoni tista 'tipprevjeni jew tillimita l-imblukkar tal-filtru billi tnaqqas id-daqs tal-aggregat, u tipprovdi rendiment ogħla. L-omoġenizzazzjoni tejbet ukoll il-kapaċità tal-filtrazzjoni tal-ħsad, li żdiedet bi 2.4-3 darbiet.

Wisq impurità tista 'tinterferixxi mal-irkupru tal-virus. L-impuritajiet għandhom it-tendenza li jimblukkaw il-filtru, u l-pori tal-membrana misduda jistgħu jirriżultaw f'rati mnaqqsa tal-passaġġ tal-virus. Fi privattiva minn de Vocht u Veenstra, jissemma li l-kjarifika diretta ta 'densità għolja taċ-ċelluli Per. Il-ġbir b'TFF({{0}}.65 jew 0.2 μm membrana) irriżulta f'irkupru tal-virus mingħajr adenovirus. L-irkupru jista 'jinkiseb bit-tneħħija selettiva tal-preċipitazzjoni tad-DNA taċ-ċellula ospitanti qabel il-pass ta' 0.65 μm TFF. 70% tal-adenoviruses.

 

 

2.3 Studju tal-każ: Ottimizzazzjoni tal-kjarifika tal-vaċċin virali

Fil-Konferenza Internazzjonali tal-2011 dwar il-Proċessi Bijoloġiċi, Sanofi Pasteur ippreżenta approċċ razzjonali għall-iskrinjar tal-filtri għall-iżvilupp ta' sekwenzi ċċarati ġodda għal vaċċini virali kandidati. Ir-riċerka għandha l-għan li tegħleb il-problemi li jiffaċċjaw fl-ottimizzazzjoni tal-proċessi tal-kultura taċ-ċelluli u tal-virus. Modifiki għall-proċess upstream irriżultaw f'telf ta 'rendiment ta' 20% u kontaminazzjoni prematura tal-filtru matul il-pass ta 'kjarifika, li rriżulta fl-ebda skala. Sabiex jiġi stabbilit pass ta 'kjarifika robust u skalabbli, kien meħtieġ żvilupp mill-ġdid sħiħ tas-sekwenza tal-filtru, b'rati ta' rkupru virali ogħla minn 85%.

Based on internal experience and scientific publications, the team selected 27 filters for an initial screening study. Small scale virus adsorption tests were performed on various filter media (polypropylene, nylon, cellulose ester, glass fiber, charged adsorption filter) and structures (pleated or deep filter). The virus yield was measured by ELISA and the clarifying efficiency of the preselected filtrate was compared by checking the reduction of turbidity. Preliminary screening studies showed that nylon and charged filters retained viral particles and virus recovery. Ten percent. The virus recovery rate of polypropylene and polyether sulfone filter was >. 80%. Ir-rata ta 'rkupru ta' ester taċ-ċelluloża u filtri tal-fibra tal-ħġieġ tiddependi fuq l-evalwazzjoni tal-filtru (20% jew 90%).

Bħala t-tieni pass, Sanofi Pasteur evalwat diversi kombinazzjonijiet (sekwenzi ta' fażi 2 jew fażi 3) tas-seba' filtri magħżula minn qabel fl-istudju ta' skrining. It-test tal-klassifikazzjoni tal-fluss kostanti sar b'filtru żgħir. Barra minn hekk, dan l-esperiment uża rendiment ogħla mill-istudju ta 'screening. Ibbażat fuq ir-riżultati tal-irkupru virali u l-kapaċità tal-filtru, it-tim għażel l-aħjar żewġ kombinazzjonijiet għal aktar studju.

- Sekwenza 1 (Stadju 2): 30 μm prefiltru tal-polypropylene mitwi nominali nominali, segwit minn ester taċ-ċelluloża kompost u filtru b'ħafna saffi tal-fibra tal-ħġieġ (porożità 1/0.5 μm)

- Sekwenza 2 (stadju 3): l-istess prefiltru (filtru tal-polypropylene nominali ta' 30 μm), segwit minn filtru intermedju tal-polypropylene b'ħafna saffi u finalment film tal-poliether sulfone asimmetriku.

 

The robustness of these two clarified sequences has been challenged by repeated constant flow sizing experiments with different harvest batches. While both potential sequences demonstrated enhanced capabilities compared to the reference sequence, only sequence 1 achieved virus recovery objectives (>85%), kif muri fil-Figura 1.

Figura 1 Irkupru medju tal-virus f'kull pass tal-filtrazzjoni. Studji ta' stabbiltà ġew evalwati għal tliet sekwenzi ta' filtrazzjoni, li minnhom is-sekwenza 1 biss bl-użu ta' polypropylene mitwi nominali ta' 30 μm u ester taċ-ċelluloża ta' 1.0/0.5 μm u filtru tal-fibra tal-ħġieġ laħqu l-mira globali ta' rkupru .

Iċ-ċentrifugazzjoni ġiet evalwata wkoll bħala l-pass primarju ta' kjarifika, segwit minn filtrazzjoni finali ta' {{0}}.45 μm. Ġew ittestjati diversi pari veloċità/tul. Għalkemm ir-rata ta 'filtrazzjoni ta' 0.45 μm żdiedet b'żewġ darbiet, ir-rendiment finali kien inqas mill-mira ta '85%. Bħala riżultat, iċ-ċentrifugazzjoni ma ġietx studjata aktar.

Fl-aħħarnett, il-prestazzjoni tas-sekwenzi tal-filtrazzjoni tal-polypropylene u tal-fibra tal-ħġieġ ġiet evalwata fuq skala akbar (daqs tal-bijoreattur ta '160 L). Is-sekwenza tal-filtru tidher fil-Figura 2.

Figura 2 Tiċċara l-kombinazzjoni tal-filtru u rappreżentazzjoni grafika tar-rendiment tal-pass tas-sekwenza. Il-ferrovija A hija l-proċess tradizzjonali u l-ferrovija B hija l-proċess ottimizzat. Is-sekwenza ottimizzata B tista 'tnaqqas iż-żona ta' prefiltrazzjoni bi 3 darbiet, tikkanċella l-pass intermedju ta 'filtrazzjoni, u tnaqqas iż-żona ta' filtrazzjoni finali b'10 darbiet, u b'hekk iżżid l-irkupru globali tal-virus bi 3%.

Diversi lottijiet ġew iċċarati b'suċċess mingħajr ebda sinjali ta 'bblukkar tal-filtri, ħin tal-proċess f'konformità mal-limiti tal-produzzjoni, u rendiment tal-virus ta'> ħamsa u tmenin fil-mija. L-ottimizzazzjoni tal-pass tal-kjarifika ma kellha l-ebda effett fuq il-passi downstream u l-attributi ewlenin tal-kwalità tal-vaċċin. Għalhekk, is-sekwenza ta 'kjarifika magħżula ntużat fil-proċess tal-produzzjoni tal-vaċċin (bijoreattur ta' daqs 1000 L) u l-prestazzjoni ġiet ikkonfermata b'suċċess.

 

03 Kjarifika ta' vaċċini batteriċi

3.1 Konsiderazzjonijiet għall-kjarifika ta' vaċċini batteriċi

Skont it-Teżawru Mediku (2015), vaċċin batterjali huwa definit bħala sospensjoni ta' batterji dilwiti jew maqtula jew id-derivattivi antiġeniċi tagħhom li jintuża biex jinduċi rispons immuni biex jipprevjeni jew jikkura mard batterjali. B'mod aktar ġenerali, il-vaċċini batterjali jistgħu jinqasmu f'erba' sottokategoriji bbażati fuq it-tip ta 'antiġen attiv. Dan l-aġent jista' jkun:

- Joqtol jew idgħajjef il-batterji ħajjin kollha. Magħruf ukoll bħala l-vaċċin BCG.

- Purifikazzjoni ta' determinanti antiġeniċi (vaċċini ta' subunità). Vaċċin tal-anthrax jew vaċċin tal-pertussis aċellulari.

- Tossini batteriċi (tossojdi). Tossojdi tad-difterite u tat-tetnu.

- Plażmid (pDNA).

Minħabba l-eteroġeneità wiesgħa tal-prodotti tal-familja, l-isfidi tal-proċess upstream u downstream jiddependu ħafna fuq it-tip ta 'vaċċin li qed jiġi prodott. Għalhekk, wara li l-pass inizjali tal-fermentazzjoni jista 'jiġi ppurifikat jew mhux ppurifikat, sabiex il-pass ta' kjarifika jkun jista 'jitwettaq.

 

3.2 Strateġija ta' kjarifika ta' vaċċin batterjali

3.2.1 Toxoid

Iż-żewġ tossojdi l-aktar komuni prodotti għall-użu tal-vaċċin huma d-difterite u t-tetnu, li huma prodotti minn Corynebacterium diphtheriae u Clostridium tetani, rispettivament. Il-produzzjoni taż-żewġ vaċċini hija soġġetta għal rekwiżiti regolatorji stretti. Ir-rapport tekniku tad-WHO u l-annessi tiegħu jagħmlu rakkomandazzjonijiet ċari biex jiżguraw il-kwalità, is-sikurezza u l-effettività tat-tilqim tat-tetnu u tad-difterite. Il-Prattiċi Tajba Ġenerali tal-Manifattura japplikaw għall-produzzjoni taż-żewġ vaċċini, u l-impjegati għandhom ikunu mħarrġa sew u jirċievu tilqim booster kontra ż-żewġ mardiet.

Il-GMP tirrikjedi b'mod strett li l-purità u l-kwalità tal-prodott finali għandhom jintwerew. Skont id-WHO u l-EP, l-effikaċja ta’ vaċċin finali tat-tetnu trid tiġi determinata b’paragun in vivo jew ma’ kwalunkwe metodu ieħor ippruvat b’sustanza ta’ referenza xierqa kkalibrata f’unitajiet internazzjonali skont l-Istandard Internazzjonali għat-tossojd tat-tetnu. Ir-rekwiżiti aġġornati għall-effikaċja ġew ippubblikati fl-2011 u jistgħu jvarjaw skont il-metodu tal-valutazzjoni. Is-sigurtà (tossiċità ħielsa mit-tossini u ristorattiva) ta' kull lott ta' vaċċin trid tintwera wkoll. Fl-aħħar nett, trid tiġi indirizzata l-istabbiltà tal-vaċċini, speċjalment f'ħin reali.

 

3.2.2 Vaċċin tad-DNA tal-Plasmid

Il-vaċċini tad-DNA tal-plażmidi jintużaw għal skopijiet ta 'saħħa tal-annimali, u diversi vaċċini tad-DNA tal-plażmidi għall-użu mill-bniedem jinsabu f'diversi stadji ta' żvilupp u evalwazzjoni klinika. Wara l-fermentazzjoni ta 'E. coli, il-batterji jinġabru u jinqasam biex jirrilaxxa d-DNA tal-plasmid.

It-tneħħija ta 'debris taċ-ċelluli normalment titwettaq permezz ta' ċentrifugazzjoni jew filtrazzjoni. Is-suġġett ġie kopert b’mod estensiv f’pubblikazzjonijiet riċenti. F'din il-pubblikazzjoni, proċessi u sfidi attwali upstream, downstream, u formulazzjoni pDNA.

L-awturi jipprovdu wkoll ħarsa lejn il-lakuni f'kull pass tal-proċess tipiku tal-manifattura tal-pDNA u innovazzjonijiet futuri potenzjali u/jew nuqqasijiet fit-teknoloġija attwali li jistgħu jwasslu għal aktar ottimizzazzjoni tal-proċess.

Vaċċini tad-DNA tal-plażmidi huma ppreparati f'żewġ stadji. L-ewwel, iċ-ċelluli batteriċi jitneħħew mill-mezz tal-kultura, u t-tieni, id-debris taċ-ċelluli wara li titneħħa l-liżi taċ-ċelluli. Skont l-iskala, iċ-ċelloli jinġabru permezz ta 'ċentrifugazzjoni jew mikrofiltrazzjoni TFF. Iċ-ċentrifuga tal-munzell tad-diska tintefa 'b'mod intermittenti b'veloċità għolja, u r-rendiment ta' plasmidi supercoiled huwa fqir minħabba ħsara ta 'shear waqt il-ħruġ. Jekk trid tintuża ċ-ċentrifugazzjoni, ċentrifuga ta 'skutella solida hija l-aħjar. Kanal miftuħ, apparati TFF ċatti b'membrani ta 'mikrofiltrazzjoni ta' 0.1 jew 0.2 μm jew apparati ta 'fibra vojta jistgħu jaħdmu tajjeb.

Minħabba li l-apparati tal-fibra vojta għandhom kapaċità ta 'tagħbija solida għolja, xi drabi jingħataw prijorità. Tipikament dawn il-proċessi joperaw f'{0}} darbiet il-konċentrazzjoni, segwiti minn 3-5 volumi ta' trasfiltrazzjoni. Sabiex titnaqqas il-shear u l-polarizzazzjoni tal-membrana ta 'kontroll aħjar, operazzjonijiet ta' kontroll tal-penetrazzjoni huma rakkomandati ħafna. Għalkemm iċ-ċentrifugi huma aktar kosteffettivi f'operazzjonijiet kummerċjali fuq skala kbira, proċessi fuq skala iżgħar għandhom it-tendenza li jużaw filtrazzjoni minħabba l-portabbiltà u l-faċilità ta 'tħaddim.

Flocculants intużaw biex jiffaċilitaw l-ipproċessar, iżda jista 'jwassal għal telf ta' prodott. Xi wħud jirrakkomandaw ukoll l-użu ta 'partiċelli tad-dinja diatomaceous inerti, segwiti minn filtrazzjoni tal-borża.

Cell lysis produces viscous products, including large particles, cell fragments, soluble impurities, fine colloidal particles, and pDNA. Due to the complexity of the material, removing such fine solids is a difficult separation. Gradient density deep filter or open hole structure (>0.45m) il-filtri tal-membrana huma tajbin biex ineħħu d-debris taċ-ċelluli. Minħabba l-imblukkar qawwi ta 'debris taċ-ċelluli, filtrazzjoni ta' fluss baxx jew ta 'pressjoni baxxa hija preferuta. Mikrofiltri bbażati fuq Tff intużaw għal dan il-pass u filtri tal-borża fuq skala industrijali. Il-qsim statiku (f'kontenitur tat-taħlit) u kontinwu (bl-użu ta 'mixer statiku in-line) jeħtieġ filtri differenti.

 

3.3 Studju tal-każ: Tqabbil tal-effikaċja taċ-ċentrifugazzjoni, il-metodi NFF u TFF biex jiġu ċċarati t-tossini tat-tetnu

Muniandi et al. qabbel tliet metodi differenti biex jiġu ċċarati t-tossini tat-tetnu u t-tossojdi minn fluwidi tal-fermentazzjoni, jiġifieri ċentrifugazzjoni, filtrazzjoni fil-fond (NFF), u TFF. Il-materjal tat-test ġie prodott f'fermentatur ta' 400L bl-użu ta' medium Miller (MMM) modifikat. Fl-istudju taċ-ċentrifugazzjoni, iċ-ċelloli ġew separati mill-qalb f'4000 RPM f'kontenitur ta '6 × 1L għal 60min. Ittieħdu kampjuni tas-supernatant biex jinstab l-irkupru tat-tossojdi. Il-filtrazzjoni fil-fond tuża filtri fil-fond ta '0.45μm u 0.22μm li fihom art tad-diatomaceous u ċelluloża biex tiċċara l-brodu tal-fermentazzjoni. Il-proċess jitwettaq f'temperatura ta '35 grad u 12psi.

Modulu TFF ta 'pannell ċatt miftuħ huwa magħqud termalment ma' membrana PVDF 0.22μm fil-metodu TFF. Il-proċess ta 'kjarifika bbażat fuq TFF sar b'rata ta' fluss inkroċjat ta '2000 L/h fi 23 grad, u l-filtrat ċċarat kien ikkonċentrat b'rata ta' fluss inkroċjat ta '1000 L/h f'25 grad bl-użu ta' membrana TFF sandwich 30kD PES konvenzjonali. Il-likwidu tal-laħam iċċarat (madwar 6L) huwa kkonċentrat 10 darbiet f'dan il-proċess ta 'ultrafiltrazzjoni. It-testijiet tat-tossojdi tat-tetnu twettqu fuq kampjuni konċentrati ta' retainer biex jiġi vvalutat l-irkupru tal-prodott.

Filtrazzjoni profonda rriżultat f'rata ta 'rkupru tal-prodott ta' madwar 89%, b'unitajiet TFF li jirriżultaw f'rata ta 'rkupru tal-prodott ta' aktar minn 97%. Il-proċessi ta 'mikrofiltrazzjoni u ultrafiltrazzjoni b'mod konsistenti jagħtu rkupri ta' prodotti ogħla mill-proċess NFF. Dawn ir-riżultati huma bbażati fuq testijiet tal-flokulazzjoni (Lf).

 

04Kjarifika tal-vaċċini tal-polysaccharide

4.1 Konsiderazzjoni tal-kjarifika tal-vaċċin tal-polysaccharide

Il-proċess tal-produzzjoni kemm ta 'vaċċini ta' polysaccharide mhux akkoppjati/ħieles kif ukoll ta 'vaċċini ta' polysaccharide akkoppjati jibda bil-kultura tal-batterja ospitanti f'fermentatur. Fl-aħħar tal-fermentazzjoni, il-batterji jistgħu jiġu ttrattati b'aġenti tat-tindif bħal DOC (sodium deoxycholate), Triton®X-100, jew reaġenti xierqa oħra biex jeqirdu l-batterja u jippromwovu r-rilaxx tal-polisakkaridi. Minħabba l-kapaċità kbira tal-batterija, il-ġbir direttament permezz tal-NFF mhuwiex ekonomikament fattibbli peress li l-fluss jista 'jkun baxx ħafna. Għalhekk, l-għażla ideali hija li tuża ċentrifuga biex tissepara l-gruppi taċ-ċelluli. Il-firxa ta 'mikrofiltrazzjoni TFF tista' tintuża wkoll. Iċ-ċentru/penetrant mingħajr ċelluli li fih il-polisakkarid ta 'interess huwa ċċarat aktar permezz ta' sistema ta 'filtrazzjoni profonda NFF, segwita minn filtrazzjoni biobattered, u mbagħad ipproċediet għal trattament downstream għal aktar purifikazzjoni.

 

4.2 Strateġija ta' kjarifika tal-vaċċin tal-polysaccharide

4.2.1 L-Ewwel Proċedura ta' Kjarifika

Iċ-ċentrifugazzjoni hija waħda mill-aktar tekniki komuni għas-separazzjoni taċ-ċelloli mill-fluwidi tal-fermentazzjoni. Skont l-iskala, jistgħu jintgħażlu ċentrifugazzjoni kontinwa jew ċentrifugazzjoni tal-lott. Huwa importanti li wieħed jinnota li l-ottimizzazzjoni xierqa tal-kundizzjonijiet taċ-ċentrifugazzjoni u t-tħaddim tagħhom hija essenzjali għal purifikazzjoni downstream b'suċċess. Meta tagħżel membrana TFF speċifika u daqs tal-pori, huwa importanti li wieħed iżomm f'moħħu l-piż molekulari tal-polisakkaridi, li ħafna drabi huma kbar u strutturalment kumplessi, b'piżijiet molekulari li jvarjaw minn madwar 500kDa għal aktar minn 1000kDa. Minħabba d-daqs kbir tal-pori miftuħa, l-użu ta 'membrani MF 0.22μm, 0.45μm, 0.65μm jista' jiżgura l-irkupru b'suċċess tal-molekuli PS fis-soluzzjoni osmotika.

 

4.2.2 Proċedura ta' Kjarifika Sekondarja

Iċ-ċarezza/turbidità tas-soluzzjoni ta 'fermentazzjoni mingħajr ċelluli li tilħaq il-pass ta' kjarifika sekondarja tiddependi fuq il-batterja speċifika, it-tip ta 'qsim, it-tip ta' serum individwali, u t-teknika użata għall-pass ta 'kjarifika primarja. It-turbidità taċ-ċentru tista 'tvarja minn madwar 50 sa 150 NTU. Filtru fond ta 'densità frazzjonali iċċarġjata b'mod pożittiv magħmul minn diatomite mimli b'fibri taċ-ċelluloża mimlija jista' jintuża biex jiċċara u jnaqqas it-turbidità tiegħu għal < 5NTU.

Il-volum throughput ta' dan il-filtru profond jista' jvarja minn madwar 150 L/m3 sa 250 L/m3. Tipikament, is-soluzzjoni tal-prodott iċċarata hija ffiltrata permezz ta 'grad ta' tnaqqis sussegwenti 0.45 μm jew membrana ta 'grad sterilizzat ta' 0.22 μm biex tneħħi kwalunkwe partiċelli taċ-ċelluli, kollojdi u mikro-organiżmi potenzjali li jifdal.

 

4.3 Studju ta' każ: Kjarifika taċ-ċentru tal-brodu tal-fermentazzjoni ta' Streptococcus pneumoniae wara ċ-ċentrifugazzjoni

Iċ-ċelloli ġew isseparati biż-żieda ta' {{0}}.1% (v/v) brodu ta' fermentazzjoni Streptococcus pneumoniae tat-tip 8 (20 L) permezz ta' ċentrifugazzjoni kontinwa. Iċ-ċentru tal-kollezzjoni huwa ffiltrat permezz ta 'żewġ filtri separati iċċarġjati b'mod pożittiv u tad-diatomaceous earth fil-fond li fihom fibri taċ-ċelluloża. Il-filtrat tal-filtru fil-fond individwali mbagħad ġie ffiltrat permezz ta 'membrana PVDF 0.45μm ta' grad ta 'tnaqqis bioloaded. It-testijiet kollha ta 'filtrazzjoni saru f'modalità ta' fluss kostanti b'pompi peristaltiċi. Testijiet ta' filtrazzjoni bl-użu ta' filtru fond iċċarġjat u brodu ta' fermentazzjoni tas-serotip 8 ta' Streptococcus pneumoniae irriżultaw f'turbidità li niżlet minn madwar 120 NTU għal 3 NTU. It-testijiet twettqu b'rata ta' fluss ta' 140,150 L/m2 /siegħa u differenza ta' pressjoni ta' punt aħħari ta' 20-25 psi, b'volum ta' throughput ta' madwar 180-200 L/m2.

Testijiet ta 'filtrazzjoni simili saru fuq il-brodu ta' fermentazzjoni ta 'Streptococcus pneumoniae serotip 19A. Il-likwidu ċentrifugat 19A jiġi ċċarat permezz ta 'filtru fond iċċarġjat, li jnaqqas it-turbidità minn madwar 40 NTU għal 3 NTU. It-testijiet twettqu b'rata ta' fluss kostanti ta' madwar 140-160 L/ m2 /hr, u ħruġ volumetriku ta' 200-230 L/ m2 inkiseb fi pressjoni ta' tmiem ta' madwar 15 psid. L-analiżi HLPC tal-kampjuni tal-prodott miġbura waqt it-testijiet tal-valutazzjoni tal-filtrazzjoni ma wriet l-ebda telf ta 'rendiment sinifikanti għal filtrazzjoni profonda jew membrani ta' 0.45 μm (jew 0.22 μm).

 

05 Konklużjoni

L-iżvilupp ta 'proċessi ta' kjarifika jeħtieġ l-integrazzjoni ta 'diversi proċessi ta' unità bħal ċentrifugazzjoni, TFF-MF, filtrazzjoni profonda u filtrazzjoni asettika. L-ottimizzazzjoni tal-proċess ta 'kjarifika teħtieġ fehim ta' kif operazzjonijiet ta 'unità differenti jaffettwaw lil xulxin. L-isfida hija li jintgħażlu teknoloġiji u għodod (tagħmir u attrezzaturi) biex jissodisfaw ir-rekwiżiti dejjem aktar kumplessi tal-fluwidi tal-proċess prodotti mill-bijoreatturi aktar effiċjenti tal-lum. Iż-żieda fil-produttività upstream (titer virali, densità taċ-ċelluli, eċċ.), debris taċ-ċelluli, u prodotti ta 'liżi taċ-ċelluli żżid id-diffikultà tal-proċess ta' kjarifika u tħawwad l-għażla ta 'tagħmir ta' separazzjoni u filtrazzjoni.

Id-disinn tat-tagħmir, il-faċilità tal-użu u l-indafa għandhom jiġu kkunsidrati meta ssir l-għażla tal-iskala tal-proċess. Dan se jiżgura konverżjoni effiċjenti u sikurezza tal-operatur meta jittratta filtri mormija. Sabiex jiġi żviluppat il-proċess ta 'kjarifika, integrazzjoni qawwija tal-passi ta' kjarifika hija importanti biex jiġi żgurat li l-ipproċessar tal-ħsad upstream ikun kosteffettiv. Firxa ta 'unitajiet ta' filtrazzjoni huma faċilment disponibbli biex jiffaċilitaw l-ittestjar fil-laboratorju, il-produzzjoni pilota, u l-ipproċessar ta 'daqs sħiħ. Bl-implimentazzjoni ta 'pjan ta' ħidma ta 'scale-up iddisinjat tajjeb li jevalwa għażliet multipli ta' kjarifika, wieħed jista 'jagħżel b'mod kunfidenti u qies il-filtri ta' kjarifika biex jipproteġi l-operazzjonijiet ta 'unità downstream filwaqt li jnaqqas l-ispejjeż operattivi.

Il-kjarifika tat-tilqim tippreżenta diversi sfidi. Tipikament, il-proċess ta 'filtrazzjoni jeħtieġ li jkun imfassal apposta għas-sistema ta' produzzjoni, l-aġent ta 'inattivazzjoni jew liżi, u l-preżentazzjoni tal-antiġen, mhux neċessarjament vaċċini. Il-proċessi tradizzjonali tat-tilqim tipikament jużaw iċ-ċentrifugazzjoni biex inizjalment jiċċaraw il-vaċċin. Vaċċini moderni bi pjattaformi teknoloġiċi multipli u volumi ta 'proċessar iżgħar jagħmlu l-vaċċini aktar adattati għall-kjarifika permezz ta' teknoloġiji bbażati fuq il-membrana. Vaċċini żviluppati reċentement li jużaw linji ta 'ċelluli moderni u sistemi ta' espressjoni u li jużaw kundizzjonijiet ta 'kultura taċ-ċelluli aktar definiti jagħmlu ħafna proċessi ta' vaċċin aktar li jwasslu għall-filtrazzjoni.

 

Madankollu, l-eteroġeneità fil-komponent antiġeniku jew "antiġen fil-mira" tal-prodotti tal-vaċċin iżżid il-kumplessità tal-kjarifika tal-filtrazzjoni. L-antiġeni jvarjaw fid-daqs, fil-kimika tal-wiċċ, u fil-ħlas. Dawn il-karatteristiċi jaffettwaw ir-rendiment u l-irkupru ta 'antiġeni. Il-vaċċini jippreżentaw sfidi uniċi għall-kjarifika, prinċipalment minħabba d-daqs tal-makromolekuli tagħhom. Dan, flimkien ma' kwistjonijiet ta' kapaċità madwar il-kjarifika, iżid il-ħtieġa għal gwida dwar strateġiji ta' żvilupp tal-proċess.

Id-daqs u l-iskala ta 'operazzjoni fuq skala kummerċjali għall-produzzjoni tal-vaċċini għandhom impatt sinifikanti fuq l-għażla tat-teknoloġija ta' kjarifika. Li tkun tinsab 'il fuq mill-proċess, l-ottimizzazzjoni ta' kjarifika xierqa hija kritika għas-suċċess ta 'operazzjonijiet ta' unità downstream, li timmassimizza r-rendiment, l-irkupru u r-robustezza tal-proċess. Filwaqt li ċ-ċentrifugazzjoni tibqa 'għażla teknika vijabbli għall-kjarifika primarja, unitajiet ta' mikrofiltrazzjoni ta 'kanal miftuħ (TFF) għal kjarifika primarja u filtri profondi fini jew filtri tal-membrana għal kjarifika sekondarja qed jiksbu aċċettazzjoni fl-industrija tal-vaċċini. Din il-bidla hija mmexxija mill-ħtieġa għal ipproċessar aktar mgħaġġel, żvilupp ta 'proċess mgħaġġel, proċessi portabbli, u implimentazzjonijiet ta' użu wieħed. L-NFF joffri proċess ekonomiku adattat għal għażliet ta' użu wieħed fuq skala żgħira jew kbira. Minħabba l-ħtiġijiet regolatorji li qed jinbidlu, id-disponibbiltà ta 'apparati pre-settiċi ta' irradjazzjoni gamma jew moduli ddisinjati għall-awtoklavi tippromwovi adattament aktar mgħaġġel ta 'teknoloġiji bbażati fuq NFF jew TFF.

Ħafna proċessi klassiċi tal-vaċċini jinvolvu l-evoluzzjoni tal-operazzjonijiet tal-unità ta’ kjarifika, l-aktar minħabba restrizzjonijiet regolatorji u l-ispejjeż għoljin assoċjati ta’ validazzjoni mill-ġdid u sottomissjoni mill-ġdid jew provi kliniċi. Il-proċess tal-pjattaforma li juża l-iskema ta 'kjarifika bbażata fuq il-filtrazzjoni intuża ħafna f'diversi aġenti bijoloġiċi bi grad għoli ta' suċċess. L-eżempji u l-każijiet deskritti f'dan id-dokument juru li l-manifatturi tal-vaċċini għandhom il-potenzjal li jiksbu dan il-livell ta 'stabbiltà, vijabbiltà ekonomika, u utilità ta' użu wieħed billi jsegwu l-approċċ tal-mudell.

Vantaġġi oħra tal-filtrazzjoni fuq iċ-ċentrifugazzjoni huma viruses sensittivi għall-shear jew viruses li għandhom it-tendenza li jakkumulaw fl-interface tal-arja. Hekk kif il-manifatturi tal-apparat iġibu prodotti ġodda fis-suq, il-manifatturi tal-vaċċini se jkomplu jkunu mgħammra aħjar għall-proċess ta 'kjarifika.

 

Bħala l-ewwel kumpanija fiċ-ċirkwit tal-lokalizzazzjoni, Guidling Technology akkumulat biżżejjed esperjenza rilevanti fil-kjarifika tal-vaċċin. Guidling Technology hija kumpanija ta 'żvilupp u produzzjoni li tiffoka fuq kultura, purifikazzjoni u separazzjoni bijofarmaċewtika u taċ-ċelluli. Il-prodotti jintużaw ħafna fil-bijomediċina, id-dijanjosi, il-filtrazzjoni tal-fluwidu industrijali, l-iskoperta, il-kjarifika, il-purifikazzjoni u l-proċess ta 'konċentrazzjoni; Guidling żviluppa b'suċċess tubu ċentrifugu ta 'ultrafiltrazzjoni, cassette tal-membrana ta' ultrafiltrazzjoni/mikrofiltrazzjoni, filtru għat-tneħħija tal-virus, apparat tal-filtru tal-fluss tanġenzjali, munzell tal-membrana fil-fond, eċċ., Li jissodisfaw bis-sħiħ ix-xenarji ta 'applikazzjoni tal-kultura bijofarmaċewtika u taċ-ċelluli.

Il-membrani u l-filtri tal-membrana tagħna jintużaw ħafna f'konċentrazzjoni, estrazzjoni u separazzjoni ta 'prefiltrazzjoni, mikrofiltrazzjoni, ultrafiltrazzjoni u nanofiltrazzjoni. Il-firxa wiesgħa tagħna ta 'linji ta' prodotti, minn filtrazzjoni żgħira tal-laboratorju li tintuża darba għal sistemi ta 'filtrazzjoni tat-tip ta' produzzjoni, ittestjar ta 'sterilità, fermentazzjoni, kultura taċ-ċelluli u aktar, tista' tissodisfa l-ħtiġijiet ta 'ttestjar u produzzjoni.