Studju dwar il-Proċess ta' Kjarifika ta' Lisat ta' Fermentazzjoni ta' Densità Għolja Ta' Escherichia Coli Rikombinanti
Sabiex titnaqqas l-interferenza tal-fluwidu materjali għall-kromatografija u ttejjeb l-irkupru tal-proteina fil-mira, ġie studjat il-proċess ta 'kjarifika ta' lisat ta 'fermentazzjoni ta' densità għolja ta 'żewġ razez ta' Escherichia coli rikombinanti. Intgħażlu razez BL21-HP1036 u BL21-palA li jesprimu ġeni ewlenin ta' Streptococcus suis u Haemophilus parasuis. Proċess ta 'fluss tanġenzjali, proċess ta' ċentrifugazzjoni b'veloċità għolja u proċess ta 'kjarifika tal-cassette tal-membrana ntużaw biex jevalwaw ir-rendiment tal-proteini permezz ta' sejbien ta 'turbidità u elettroforeżi.
Ir-riżultati wrew li BL21-HP1036, BL21-palA lisat ta 'fermentazzjoni ta' densità għolja li jesprimi ġeni ewlenin ta 'Streptococcus suis u Haemophilus parasuis ġew iċċarati permezz ta' filtrazzjoni u ċentrifugazzjoni tal-cassette tal-membrana, u r-rendiment tal-proteini kien ta 'aktar minn 80%, li jista 'effettivament inaqqas l-interferenza kromatografika u jtejjeb ir-rata ta' rkupru.
Introduzzjoni
Fil-preżent, Streptococcus suis (SS) u Haemophilus parasuis (HPS) huma l-aktar patoġeni komuni tal-mard batterjali fl-irziezet tal-ħnieżer, li jġibu telf kbir għall-industrija tal-ħnieżer. SS jista 'jinqasam f'total ta' 35 serotip 1-34 u 1/2, u HPS jista 'jinqasam f'1-15 serotipi, u t-tnejn huma ħafna drabi mħallta, prinċipalment jikkawżaw poliserożite tal-ħnieżer, artrite, meninġite, endokardite , settiċemija batterjali u bronkite.
Minħabba n-numru kbir ta 'serotipi ta' Streptococcus suis u Haemophilus parasuis, il-protezzjoni inkroċjata bejn serotipi differenti hija dgħajfa, u r-reżistenza għall-antibijotiċi se tiżdied b'mod sinifikanti meta tiġi ttrattata b'antibijotiċi, li jaffettwaw l-effett terapewtiku.
Il-vaċċini saru wieħed mill-mezzi effettivi biex jipprevjenu SS u HPS. Hemm vaċċini inattivati, vaċċini attenwati, vaċċini ħajjin, vaċċini subunità u vaċċini ta 'inġinerija ġenetika, iżda vaċċini inattivati u vaċċini attenwati huma prinċipalment fis-suq, u l-protezzjoni immuni tagħhom hija tajba, iżda l-protezzjoni inkroċjata mhix ovvja. Vaċċin subunit huwa tip ġdid ta 'vaċċin kontra streptococcus suis, li huwa tip ġdid ta' vaċċin b'protezzjoni inkroċjata qawwija u prezz baxx. Ir-riċerka u l-iżvilupp ta 'vaċċini subunità ta' Streptococcus suis u Haemophilus parasuis jipprovdu soluzzjoni perfetta għall-problemi ta 'prevenzjoni u kontroll ta' Streptococcus suis u Haemophilus parasuis li jbatu l-industrija tal-ħnieżer fiċ-Ċina.
Il-vaċċini tas-subunità ta' Streptococcus suis u Haemophilus parasuis huma soġġetti għal fermentazzjoni ta' densità għolja minn Escherichia coli rikombinanti. Il-kjarifika tal-lisat għandha effett kbir fuq ir-rendiment tal-proteini fil-mira, iżda hemm ftit rapporti rilevanti. Kif tirrealizza l-pass ta 'kjarifika tal-proċess ta' fermentazzjoni u purifikazzjoni huwa xogħol importanti. F'dan id-dokument, rikombinanti E. coli BL21-HP1036, BL21-palA fermentazzjoni ta 'densità għolja bħala l-oġġett, biex tistudja kif tnaqqas b'mod effiċjenti t-turbidità tas-soluzzjoni ta' kjarifika, ittejjeb ir-rendiment tal-proteini, għal Proċess ta 'fermentazzjoni tal-vaċċin tas-subunità ta' Streptococcus suis biex tinkiseb teknoloġija ta 'tgħaffiġ u kjarifika industrijali biex tipprovdi bażi teoretika u appoġġ tekniku.
1. Materjali u metodi
1.1 Materjali
1.1.1 Razez
Streptococcus suis u Haemophilus parasuis razez BL21-HP1036, BL21-pa-lA
1.1.2 Midja prinċipali u reaġenti
Estratt tal-ħmira u foċena; Klorur tas-sodju; Kanamycin, IPTG; Formaldehyde minn; Kit tal-ġel SDS-PAGE.
1.1.3 Tagħmir ewlieni tat-test
Fermentatur ta 'densità għolja; Ċentrifuga b'veloċità għolja; Apparat għall-elettroforeżi; Sistema tal-immaġni tal-ġel ultravjola; Crusher ultrasoniku; Ċentrifuga żgħira ta 'veloċità għolja; Spettrofotometru ultravjola; Tabella li tħawwad temperatura kostanti; Tagħmir ta' kromatografija ta' affinità.
1.2 Metodi
1.2.1 Kultura ta 'fermentazzjoni ta' densità għolja
Ir-razez koliformi rikombinanti kwalifikati BL21-HP1036 u BL21-pa-lA ġew imlaqqma fuq medium sintetiku fi 2% (V/V) u kkultivati f'37 grad għal 35-40 siegħa.
1.2.2 Espressjoni indotta minn proteina rikombinanti
Meta s-soluzzjoni ta 'fermentazzjoni OD{{0}}±0.1, l-induzzjoni bdiet, it-temperatura ta' induzzjoni kienet 35 grad ± 0.5 grad , u l-kultura ntemmet wara 10h ta 'induzzjoni.
1.2.3 Tgħaffiġ u ċentrifugazzjoni omoġenja bi pressjoni għolja
Il-likwidu tal-batterja li għadda mit-test ta 'inattivazzjoni ġie mgħaffeġ minn omoġenizzatur ta' pressjoni għolja għall-qsim taċ-ċelluli rispettivament, bi pressjoni ta '100 ~ 150 MPa. Wara t-tgħaffiġ, il-likwidu mgħaffeġ inżamm f'temperatura baxxa.
Is-supernatant inkiseb biċ-ċentrifuga b'veloċità għolja, veloċità ċentrifugali: 15000 rpm, kontroll tat-temperatura: 10 grad ~ 15 grad, veloċità ta 'injezzjoni: 0.5 ~ 1 L/min, rispettivament, is-supernatant inġabar, u l- is-supernatant kien mimli b'kontenituri li neħħew l-endotossina.
1.2.4 Kjarifika tal-cassette tal-membrana tal-mikrofiltrazzjoni
Il-membrana ġiet maħsula b'10L ta 'ilma purifikat f'direzzjoni waħda, u twettqet filtrazzjoni tan-nixxiegħa tanġenzjali. 300 mL tas-sospensjoni batterjali miksura wara ċ-ċentrifugazzjoni ttieħdu miċ-ċentrifuga tal-pipeline u ġew iċċarati b'cassette tal-membrana ta 'mikrofiltrazzjoni 0.45um. It-turbidità kienet imkejla billi jittieħdu kampjuni rispettivament, u t-turbidità wara ċ-ċentrifugazzjoni, it-turbidità tal-likwidu ċċarat fil-cassette tal-membrana tal-mikrofiltrazzjoni u t-turbidità tal-likwidu kkonċentrat fil-cassette tal-membrana tal-mikrofiltrazzjoni tqabblu. Il-kontenut tal-proteini tal-kampjun ġie skopert bil-kromatografija u l-elettroforeżi biex tiġi evalwata r-rendiment tal-proteini.
Pass 2: Riżultati
2.1 Dejta ta' kjarifika u riżultati tat-test tal-proteina BL21-HP1036 u BL21-palA
Ir-riżultati fil-FIG. 1 juri li t-turbidità tal-fluwidu tat-tgħaffiġ rikombinanti ta' Escherichia coli BL21-HP1036 u BL21-palA naqset minn 4 500 NTU u 4 000 NTU għal 1970 NTU u 520 NTU, rispettivament, wara ċ-ċentrifugazzjoni tat-tubu. It-turbidità ta' BL21-HP1036 u BL21-palA Escherichia coli rikombinanti tnaqqset għal 25 NTU u 1.28 NTU permezz tal-metodu ta' cassette tal-membrana ta' mikrofiltrazzjoni. Wieħed jista 'jara li l-użu ta' filtrazzjoni tanġenzjali tal-fluss tanġenzjali tal-cassette tal-membrana tal-mikrofiltrazzjoni u kanal tal-fluss miftuħ ottimizzat għandu effett tajjeb fuq it-tnaqqis tal-endotossina, il-viskożità u t-turbidità tal-likwidu kromatografiku mill-filtrazzjoni ċentrifuga tradizzjonali, u jista 'jnaqqas b'mod sinifikanti l-eteroproteina rikombinanti miksura E. coli. u aċidu nuklejku.
2.2 Irkupru tal-proteini tal-kampjuni BL21-HP1036 u BL21-palA
Tabella 1 turi li l-proteina rikombinanti Escherichia coli BL21-HP1036 teżisti kemm fis-soluzzjoni ċċarata tal-mikrofiltrazzjoni kif ukoll fis-supernatant ikkonċentrat kopert mill-membrana tal-mikrofiltrazzjoni, u r-rendiment totali tal-proteini wara li tiġi rkuprata l-proteina mis-soluzzjoni ċċarata tal-mikrofiltrazzjoni u s-supernatant ikkonċentrat. hija madwar 88.5%. Il-proteina BL21-palA kienet teżisti wkoll fis-soluzzjoni ċċarata tal-exudate tal-mikrofiltrazzjoni u s-supernatant tas-soluzzjoni kkonċentrata koperta minn cassette tal-membrana tal-mikrofiltrazzjoni. Ir-rendiment totali tal-proteina BL21-PALa kien 81.5%.
3. Konklużjoni
F'dan id-dokument, ir-razez li jesprimu l-ġeni ewlenin BL{{0}}HP1036 u BL21-palA ta' Streptococcus suis u Haemophilus parasuis rispettivament għaddew minn fermentazzjoni ta' densità għolja u għaddew minn 0.45 It-turbidità tal-likwidu materjali kienet imnaqqas b'mod sinifikanti mill-proċess tal-cassette tal-membrana tal-mikrofiltrazzjoni um, li jindika li t-teknoloġija tal-filtrazzjoni tanġenzjali tal-fluss b'cassette tal-membrana tal-mikrofiltrazzjoni kienet aħjar minn dik b'ċentrifuga b'veloċità għolja, u setgħet tnaqqas b'mod sinifikanti l-proteina tal-impurità u l-aċidu nuklejku tal-Escherichia coli rikombinanti miksur.
Wara li ġabar il-likwidu ċar fil-cassette tal-membrana tal-mikrofiltrazzjoni waħda, kien hemm 62.9% Peress li 37.1% tal-proteina fil-mira ta 'BL21-HP1036 kienet konċentrat ta' mikrofiltrazzjoni jew kienet teżisti fil-cassette tal-membrana tal-mikrofiltrazzjoni u telf ieħor , ġie adottat metodu f'żewġ stadji għall-kjarifika. Fl-ewwel pass, intuża cassette tal-membrana tal-mikrofiltrazzjoni 0.45um biex jiċċara u jiġbor l-exudate; fit-tieni pass, il-likwidu kkonċentrat li kien fadal inġabar wara ċ-ċentrifugazzjoni tat-tubu, u l-likwidu ċċarat f'żewġ stadji ġie kkombinat bħala l-kampjun kromatografiku Il-valur tat-turbidità tal-likwidu ta 'fermentazzjoni BL21-palA ma żdiedx b'mod sinifikanti, ir-rendiment tal-proteini jista' jilħaq aktar minn 85.5%, u r-rendiment tal-proteini tal-likwidu tal-fermentazzjoni BL21-Pala jista 'jilħaq 81.5% wara trattament f'żewġ stadji.
Fir-rigward ta 'kif tagħżel il-cassette tal-membrana tal-mikrofiltrazzjoni, Guidling Technology tista' tagħtik soluzzjonijiet ta 'kwalità għolja. Il-prodotti tagħna tas-serje tal-cassette tal-membrana tal-mikrofiltrazzjoni u l-ultrafiltrazzjoni tal-membrana jużaw polyether sulfone bħala t-trasportatur, iddisinjat apposta għall-bijoteknoloġija. Il-membrana tal-polyether sulfone tagħna għandha l-vantaġġi ta 'produzzjoni għolja, assorbiment baxx ta' proteina, saħħa mekkanika għolja, reżistenza għall-impatt u l-bqija. Aħna nipprovdulek klampi speċjali tal-membrana biex tkejjel il-pressjoni tad-daħla u l-ħruġ f'ħin reali, u nistgħu nipprovdu żjarat tekniċi skont il-bżonnijiet tiegħek biex tippersonalizza s-sistema speċjali ta 'ultrafiltrazzjoni/mikrofiltrazzjoni tiegħek. Sistema ta 'fluss tanġenzjali żgħir bħal din tista' tintuża għal produzzjoni żgħira, pilota u fuq skala żgħira, u tista 'tkun amplifikazzjoni kompletament lineari biex tissodisfa bis-sħiħ ir-rekwiżiti tat-test u r-rekwiżiti tal-produzzjoni tiegħek.
Dwar Guidling
Guidling Technology hija intrapriża nazzjonali ta 'teknoloġija għolja li tiffoka fuq bijofarmaċewtiċi, kultura taċ-ċelluli, purifikazzjoni u konċentrazzjoni ta' bijomediċina, dijanjosi u fluwidi industrijali. Aħna żviluppajna b'suċċess apparati ta 'filtru ċentrifugali, kasetts ta' ultrafiltrazzjoni u mikrofiltrazzjoni, filtru tal-virus, sistema TFF, filtru tal-fond, fibra vojta, eċċ Li jissodisfaw bis-sħiħ ix-xenarji ta 'applikazzjoni ta' bijofarmaċewtiċi, kultura taċ-ċelluli, eċċ. Il-membrani u l-filtri tal-membrana tagħna jintużaw ħafna f'konċentrazzjoni, estrazzjoni u separazzjoni ta 'prefiltrazzjoni, mikrofiltrazzjoni, ultrafiltrazzjoni u nanofiltrazzjoni. Il-ħafna linji ta 'prodotti tagħna, minn filtrazzjoni żgħira tal-laboratorju li tintuża darba għal sistemi ta' filtrazzjoni ta 'produzzjoni, ittestjar ta' sterilità, fermentazzjoni, kultura taċ-ċelluli u aktar, jissodisfaw il-ħtiġijiet tal-ittestjar u l-produzzjoni. Guidling Technology qed jistenna bil-ħerqa li jikkopera miegħek!