Diskussjoni qasira ta 'diversi metodi uniċi ta' fibra vojta fl-inklużjoni tal-purifikazzjoni tal-bod

Inclusion Bodies (IB) huma partiċelli ta 'proteini ta' densità għolja u li ma jinħallux imgeżwer f'membrani ffurmati meta ġeni barranin huma espressi f'ċelloli prokarjotiċi, speċjalment f'Escherichia coli. Meta osservat taħt mikroskopju, IB huwa reġjun ta 'rifrazzjoni għolja, li huwa ovvjament differenti minn komponenti oħra fiċ-ċitoplasma.

Il-formazzjoni tal-korp ta 'inklużjoni hija relattivament kumplessa, relatata mar-rata tal-produzzjoni tal-proteini fiċ-ċitoplasma, il-konċentrazzjoni ta' peptidi ġenerati ġodda hija għolja, u m'hemmx biżżejjed ħin biex tintewa, sabiex jiffurmaw aggregati ta 'proteini amorfi. Il-korpi ta' inklużjoni huma bażikament komposti minn proteini, li aktar minn 50% minnhom huma prodotti kklonati. L-istruttura primarja ta 'dawn il-prodotti hija kompletament korretta, iżda l-konfigurazzjoni tridimensjonali hija żbaljata, għalhekk m'hemm l-ebda attività bijoloġika. Id-daqs tal-ġisem tal-inklużjoni huwa 0.5-1μm, li ma jinħallx fl-ilma, jinħall biss f'denaturanti bħal urea, guanidine hydrochloride, eċċ.

F'E. coli, korpi ta 'inklużjoni jistgħu jseħħu f'żewġ postijiet taċ-ċellula: ċitoplasma u ċitoplasma periferali. Il-post u l-karatteristiċi tal-korpi ta 'inklużjoni fiċ-ċellula jiddependu fuq kif il-proteini huma espressi.

L-inklużjonijiet fiċ-ċitoplasma ta 'E. coli ġeneralment ivarjaw fid-dijametru minn {{0}}.2 sa 1.5μm, u proteini differenti għandhom dijametri differenti, bħad-daqs ta' interferon huwa 0.811μm, u d-daqs ta ' prorennet huwa 1.281μm. F'xi każijiet, id-dijametru ta 'xi korpi ta' inklużjoni huwa akbar mid-dijametru ta 'E. coli, li jagħti E. coli sporġenza. B'mod ġenerali, ċellula għandha korp ta 'inklużjoni wieħed biss.

 

Purifikazzjoni tal-korp ta 'inklużjoni

 

Il-proċess ta 'purifikazzjoni tal-korp ta' inklużjoni huwa ġeneralment:

Tgħaffiġ taċ-ċelluli:

It-teknoloġija ġenerali tat-tgħaffiġ taċ-ċelluli hija: tgħaffiġ tat-tessuti b'veloċità għolja, omoġenizzazzjoni tal-omoġenizzatur tal-ħġieġ, trattament ultrasoniku, metodu ripetut ta 'friża-tidwib, trattament kimiku (ġeneralment bl-użu ta' trattament ta 'lysozyme).

 

Inklużjoni ħasil tal-ġisem:

Il-korpi ta 'inklużjoni huma partiċelli solidi inattivi ffurmati minn agglutinazzjoni intraċellulari ta' proteini espressi minn batterji, li ġeneralment jeżistu f'forma amorfa u li ma tinħallx. Fil-korp ta 'inklużjoni, il-proteina fil-mira vera tammonta biss għal madwar 50%, u l-bqija fih lipidi, lipopolisakkaridi, aċidi nukleiċi u eteroproteini, li huma marbuta mal-korp ta' inklużjoni u jaffettwaw ir-rinaturazzjoni tal-proteina tal-korp ta 'inklużjoni. Għalhekk, il-ħasil qabel id-denaturazzjoni huwa pass meħtieġ ħafna.

Barra minn hekk, il-ħasil tal-korpi ta 'inklużjoni huwa ta' għajnuna biex iżid ir-rendiment mill-ġdid ta 'proteini rikombinanti. Billi jitneħħew l-impuritajiet, l-ostakli fil-proċess ta 'rinaturazzjoni jistgħu jitnaqqsu, sabiex il-proteina tkun tista' tintewa b'mod aktar effiċjenti u immuntata b'mod korrett, u b'hekk titjieb l-attività u l-funzjoni tal-proteina‌.

Ħasil ​​użat komunement inqas minn 1% tad-deterġent newtrali, bħal Tween, Triton, Urea u NP40 flimkien ma 'EDTA u aġenti li jnaqqsu 2-mercaptotreitol (DTT), -mercaptoethanol ripetut ħafna drabi, minħabba li l-kapaċità tal-ħasil tad-deterġent hija msaħħa b' iż-żieda tas-saħħa jonika tas-soluzzjoni, fil-ħasil tal-korpi ta 'inklużjoni tista' tiġi miżjuda NaCl biex tiżdied is-saħħa jonika.

Il-korpi ta 'inklużjoni jistgħu jintużaw biex ineħħu komponenti oħra tas-soluzzjoni tat-tqassim taċ-ċelluli permezz ta' ċentrifugazzjoni jew filtrazzjoni, li t-tnejn jieħdu vantaġġ minn proprjetajiet fiżiċi differenti ta 'korpi ta' inklużjoni.

 

Ċentrifazzjoni:

Il-proteini tal-korp ta 'inklużjoni huma ħafna aktar densi mill-istess volum ta' frammenti taċ-ċelluli, għalhekk il-korp ta 'inklużjoni jista' jiġi sseparat mill-bqija taċ-ċellula permezz ta 'ċentrifugazzjoni. Iċ-ċentrifugazzjoni kontinwa hija l-operazzjoni l-aktar użata ta 'spiss biex jinkisbu korpi ta' inklużjoni fil-produzzjoni industrijali. Peress li d-densità tal-frammenti taċ-ċelluli hija iżgħar minn dik tal-korp ta 'inklużjoni, ir-rata ta' sedimentazzjoni hija iżgħar minn dik tal-korp ta 'inklużjoni. Is-sospensjoni u ċ-ċentrifugazzjoni kontinwi jistgħu jiċċentralizzaw il-biċċa l-kbira tal-korp ta 'inklużjoni, filwaqt li l-frammenti taċ-ċelluli jitneħħew gradwalment.
Filtrazzjoni (filtrazzjoni tanġenzjali tal-fluss): Minħabba d-daqsijiet molekulari differenti ta 'korpi ta' inklużjoni u proteini solubbli, jista 'jintuża l-metodu ta' filtrazzjoni, li jista 'jnaqqas l-ispejjeż operattivi u jagħmilha faċli biex tiżdied. Il-filtrazzjoni tanġenzjali tal-fluss (TFF) hija mmexxija mid-differenza tal-pressjoni transmembrana. Sustanzi u impuritajiet iżgħar mid-daqs tal-pori tal-membrana jgħaddu mill-membrana, filwaqt li impuritajiet bħal ċelloli b'partiċelli akbar huma maqbuda. L-apertura tal-membrana ġeneralment użata għall-ħasil tal-filtrazzjoni hija 0.1μm. Il-mikrofiltrazzjoni tal-fluss tanġenzjali tal-fibra vojta tista 'tittratta direttament kontenut solidu għoli ta' materjal likwidu, inqas passi, tħaddim sempliċi, il-membrana tista 'tintuża ripetutament permezz ta' tindif, tnaqqas l-investiment tat-tagħmir u l-ispejjeż operattivi, f'konformità mar-rekwiżiti ta 'produzzjoni awtomatizzata modulari.

 

Dan li ġej huwa każ ta 'applikazzjoni għall-ħasil tal-ġisem ta' inklużjoni bl-użu ta 'kolonni ta' fibra vojta ta 'Guidling.

Aħna użajna 94cm2 0.1-0.45μm fibra vojta biex tikkonċentra 250mL likwidu (piż molekulari tal-proteina fil-mira 17kd). Fil-proċess kollu tal-ħasil, ir-rata ta 'rkupru tal-proteina fil-mira u t-tnaqqis tal-fluss tal-membrana ġew investigati.

0-71min huwa l-proċess ta' konċentrazzjoni, 71-224min huwa l-proċess tal-ħasil u l-filtrazzjoni. Matul il-proċess kollu ta 'mikrofiltrazzjoni, TMP żdied gradwalment, il-veloċità tad-dħul tal-likwidu baqgħet ma nbidlitx, u l-fluss medju tal-materjal kien 12LMH.

Ir-riżultati wrew li l-proteina fil-mira kienet kompletament maqbuda, u r-rata ta 'rkupru tal-proteina fil-mira kienet aktar minn 90%. Il-kolonni tal-fibra vojta tal-gwida huma stabbli u adattati għal din l-applikazzjoni.

 

Xoljiment tal-korp ta' inklużjoni:

Il-korpi ta 'inklużjoni huma ġeneralment maħlul taħt il-kondizzjoni ta' aġent denaturant urea jew guanidine hydrochloride, u l-proteini tal-korp ta 'inklużjoni maħlul huma kompletament denaturati, jiġifieri, ħlief l-istruttura primarja u r-rabtiet kovalenti jinżammu, il-bonds idroġenu u l-bonds idrofobiċi kollha jinqerdu, u idrofobiċi ktajjen tal-ġenb huma kompletament esposti.

L-urea u l-guanidine hydrochloride huma denaturanti ta 'qawwa medja, li jitneħħew faċilment permezz ta' dijaliżi u ultrafiltrazzjoni. Il-konċentrazzjoni ġenerali ta' urea 8-10M, guanidine hydrochloride 6-8M. Id-dissoluzzjoni ta 'l-urea għandha l-vantaġġi ta' non-jonizzazzjoni, newtrali, bi prezz baxx, tneħħija ta 'proteina wara r-rinaturazzjoni mhux se tikkawża ammont kbir ta' preċipitazzjoni ta 'proteini, u korpi ta' inklużjoni maħlula jistgħu jiġu ppurifikati b'varjetà ta 'metodi kromatografiċi, għalhekk intuża ħafna .

 

Inklużjoni mill-ġdid tal-proteini tal-ġisem:

Il-proteina rikombinanti maħlula għandha tintewa b'mod korrett biex tifforma proteina funzjonali. Tekniki għar-rinaturazzjoni jinkludu dilwizzjoni ta' soluzzjoni ta' proteina għal kważi newtrali, tneħħija ta' denaturant, rinaturazzjoni fuq kolonna, u kromatografija ta' filtrazzjoni tal-ġel. Fost dawn, id-dilwizzjoni tas-soluzzjoni tal-proteina għal kważi newtrali u t-tneħħija tad-denaturant hija metodu klassiku komuni ta 'rinaturazzjoni, speċjalment il-metodu ta' rinaturazzjoni tad-dilwizzjoni għandu l-ogħla rata ta 'utilizzazzjoni.

Tneħħija tad-denaturant:

Dijaliżi: Il-vantaġġ huwa li l-volum ma jiżdiedx, u r-rata ta 'tneħħija ta' denaturant hija kkontrollata billi titnaqqas gradwalment il-konċentrazzjoni ta 'likwidu estern permeabbli, iżda jieħu żmien twil u huwa faċli biex tifforma aggregati ta' proteini inattivi, li mhux adattat għal operazzjoni fuq skala kbira u ma tistax tiġi applikata għall-iskala tal-produzzjoni.

Ultrafiltrazzjoni (TFF): faċli biex tikkontrolla l-veloċità tad-dijalisi, kemm jekk fir-riċerka u l-iżvilupp, fit-test pilota jew fil-produzzjoni, tista 'tneħħi denaturanti (bidla tal-likwidu + konċentrazzjoni) permezz ta' ultrafiltrazzjoni (TFF).

 

Purifikazzjoni tal-proteina tal-ġisem ta 'inklużjoni:

Il-metodi ta 'purifikazzjoni tal-proteini wara r-rinaturazzjoni huma simili għal dawk ta' purifikazzjoni ta 'proteini solubbli, jiġifieri kromatografija ta' skambju joniku, kromatografija ta 'filtrazzjoni ta' ġel, kromatografija ta 'affinità, preċipitazzjoni ta' melħ ta 'sulfat ta' l-ammonju, eċċ.

Il-korpi ta 'inklużjoni m'għandhom l-ebda attività bijoloġika, m'hemmx għalfejn tinkwieta dwar it-telf ta' attività tal-proteina, u ammonti kbar ta 'espressjoni mhux se jwasslu għal mewt taċ-ċelluli, u jimmassimizzaw ir-reżistenza għall-attakk tal-protease. Jiuling f'fibra vojta minn ġewwa jistgħu jiġu applikati b'mod flessibbli fil-proċess ta ' purifikazzjoni downstream tal-korpi ta ' inklużjoni. Fil-pass tal-ħasil tal-ġisem ta 'inklużjoni, prestazzjoni eċċellenti, meta mqabbla mal-ħasil ċentrifugali, l-użu ta' fibra vojta ta 'mikrofiltrazzjoni ta' disa 'età għall-ħasil tal-filtrazzjoni tanġenzjali tal-fluss jista' jqassar ħafna l-ħin tal-proċess, u r-rata ta 'rkupru ġenerali tista' tilħaq aktar minn 90%. Jiuling fibra vojta tista 'tintuża wkoll fil-pass ta' rinaturazzjoni tal-proteini tal-korpi ta 'inklużjoni. It-turbidità tal-likwidu tal-għalf iffiltrat b'fibra vojta tal-mikrofiltrazzjoni se titnaqqas b'mod sinifikanti, u r-rata ta 'rkupru tal-proteini hija għolja; L-użu ta 'fibra vojta minn ġewwa ultrafiltrazzjoni jista' mhux biss ineħħi d-denaturanti, iżda wkoll iqassar il-ħin tat-tagħbija tal-kampjun kromatografiku, sabiex jiffranka l-ħin, inaqqas il-volum tal-mili u jnaqqas l-ispiża tal-produzzjoni. Ir-rata ta 'rkupru tal-fibra vojta ta' mikrofiltrazzjoni/ultrafiltrazzjoni tvarja ma 'materjali differenti, u r-rata ta' rkupru ġenerali tista 'tilħaq 90-95%.

Guidling Technology tilqa'lek titlob kits tat-test għal reviżjonijiet relatati.

 

Dwar Guidling

Guidling Technology hija intrapriża nazzjonali ta 'teknoloġija għolja li tiffoka fuq bijofarmaċewtiċi, kultura taċ-ċelluli, purifikazzjoni u konċentrazzjoni ta' bijomediċina, dijanjosi u fluwidi industrijali. Aħna żviluppajna b'suċċess apparati ta 'filtru ċentrifugali, kasetts ta' ultrafiltrazzjoni u mikrofiltrazzjoni, filtru tal-virus, sistema TFF, filtru tal-fond, fibra vojta, eċċ Li jissodisfaw bis-sħiħ ix-xenarji ta 'applikazzjoni ta' bijofarmaċewtiċi, kultura taċ-ċelluli, eċċ. Il-membrani u l-filtri tal-membrana tagħna jintużaw ħafna f'konċentrazzjoni, estrazzjoni u separazzjoni ta 'prefiltrazzjoni, mikrofiltrazzjoni, ultrafiltrazzjoni u nanofiltrazzjoni. Il-ħafna linji ta 'prodotti tagħna, minn filtrazzjoni żgħira tal-laboratorju li tintuża darba għal sistemi ta' filtrazzjoni ta 'produzzjoni, ittestjar ta' sterilità, fermentazzjoni, kultura taċ-ċelluli u aktar, jissodisfaw il-ħtiġijiet tal-ittestjar u l-produzzjoni. Guidling Technology qed jistenna bil-ħerqa li jikkopera miegħek!