It-Teknoloġija tal-Membrana U Kjarifika tat-Tilqim (Ⅰ)
Il-vaċċini jiġu minn varjetà ta 'sorsi, inklużi estratti tat-tessuti, ċelluli batterjali, partiċelli virali, proteini u aċidi nuklejċi prodotti minn ċelloli rikombinanti tal-mammiferi, ħmira u ċelloli tal-insetti.
L-aktar metodu komuni ta 'produzzjoni tal-vaċċin huwa bbażat fuq proċess inizjali ta' fermentazzjoni segwit minn purifikazzjoni. Il-produzzjoni tal-vaċċin hija proċess kumpless li jinvolvi ħafna passi u proċessi differenti. L-għażla tal-metodu ta 'purifikazzjoni t-tajjeb hija kritika biex tinkiseb il-purità mixtieqa tal-prodott finali. Il-kjarifika tal-vaċċini hija pass importanti li għandu impatt sinifikanti fuq l-irkupru tal-prodott u l-purifikazzjoni downstream sussegwenti. Jistgħu jintużaw diversi tekniki biex jiċċaraw il-vaċċini. L-għażla tal-metodu tal-ġbir u t-tagħmir tiddependi fuq it-tip ta 'batterija, in-natura tal-prodott li qed jinġabar u l-likwidu tal-proċess. Dawn it-tekniki jinkludu filtrazzjoni tal-membrana (mikrofiltrazzjoni, filtrazzjoni tal-fluss tanġenzjali), ċentrifugazzjoni, u filtrazzjoni fil-fond (filtrazzjoni tal-fluss normali). Minn esperjenza twila, il-kjarifika tal-ħsad tal-vaċċini ġeneralment tinkiseb permezz ta 'ċentrifugazzjoni segwita minn filtrazzjoni fil-fond.
F'dawn l-aħħar snin, tekniki bbażati fuq membrana kisbu prominenza fil-kjarifika tal-vaċċini. Il-proċessi upstream qed jużaw dejjem aktar teknoloġiji li jintremew, għalhekk l-istrateġiji tal-ħsad iridu jinbidlu. Dan l-artikolu jipprovdi ħarsa ġenerali komprensiva ta 'teknoloġiji differenti bbażati fuq membrana u l-applikazzjonijiet tagħhom fil-kjarifika tal-vaċċini.
01 Introduzzjoni
Il-vaċċini huma komponent kritiku tal-prevenzjoni tagħna ta 'mard infettiv, li jibqa' kawża xokkanti tal-mewt. Bejn 2 u 3 miljun ruħ jiġu salvati mid-difterite, it-tetnu, is-sogħla konvulsiva u l-ħosba kull sena grazzi għat-tilqim. Il-vaċċini jkopru firxa wiesgħa, minn proteini rikombinanti żgħar sa partiċelli tal-virus sħaħ u batterji sħaħ. Jistgħu jiġu prodotti minn sistemi differenti: bajd, ċelloli tal-mammiferi, batterji, eċċ. Minħabba l-kumplessità u d-diversità tal-vaċċini, bħalissa m'hemm l-ebda protokoll jew mudell ta 'purifikazzjoni mainstream, minkejja l-interess dejjem jikber fil-pjattaformi tal-vaċċini.
Tipikament, proċess ta 'vaċċin jista' jinqasam fi tliet partijiet: upstream (produzzjoni u kjarifika), trattament downstream (purifikazzjoni inkluż ultrafiltrazzjoni, kromatografija u trattament kimiku), u formulazzjoni (operazzjonijiet ta 'mili finali). Indipendenti mis-sistema tal-produzzjoni, il-kjarifika (it-tneħħija inizjali ta 'sustanzi mhux mixtieqa) għandha rwol ewlieni fid-determinazzjoni ta' proċess ta 'purifikazzjoni robust. Pass ta 'kjarifika xierqa prinċipalment ineħħi ċelluli sħaħ, debris taċ-ċelluli, kollojdi, u aggregati kbar biex jitnaqqas il-piż tal-ipproċessar downstream. F'xi każijiet, il-kjarifika tista 'wkoll tnaqqas l-impuritajiet li ma jinħallux, il-proteini taċ-ċelluli ospitanti (HCP), u l-aċidi nukleiċi taċ-ċelluli ospitanti. Bħal kull pass ieħor ta 'purifikazzjoni, il-pass ta' kjarifika jeħtieġ li jiġi ottimizzat biex jinkiseb rendiment massimu u purità tal-prodott filwaqt li jadatta għall-ispeċifiċità u r-restrizzjonijiet tal-produzzjoni tal-vaċċin.
Minħabba l-eteroġeneità tat-tipi ta 'vaċċini, varjetà ta' tekniki huma użati għall-kjarifika, inkluż ċentrifugazzjoni jew filtrazzjoni (Tabella 1).
Ġeneralment huma meħtieġa diversi serje ta' operazzjonijiet biex tinkiseb il-kjarifika mixtieqa. L-ewwel operazzjoni hija ddisinjata biex tneħħi partiċelli akbar (kjarifika primarja) u t-tieni operazzjoni hija mfassla biex tneħħi kollojdi u partiċelli sub-micron oħra (kjarifika sekondarja). Iċ-ċentrifugazzjoni b'veloċità baxxa sservi bħala għażla ta 'kjarifika ta' darba, li tippermetti li ċ-ċelloli u d-debris taċ-ċelluli jitneħħew permezz tal-preċipitazzjoni. Iċ-ċentrifugazzjoni tista 'timmaniġġja tagħbijiet solidi għoljin u ġiet użata ħafna fil-lott jew mod kontinwu u ċentrifugi tad-diska. Jeħtieġ investiment kapitali għoli u spejjeż ta’ manutenzjoni, u tiffaċċja sfidi fit-tkabbir minħabba n-nuqqas ta’ mudell affidabbli ta’ tnaqqis. Madankollu, xi manifatturi tal-vaċċini kummerċjali jużaw ċentrifugi fi produzzjoni fuq skala kbira li tinvolvi volumi ta 'proċessar għoljin u aktar attivitajiet ta' produzzjoni.
Il-filtrazzjoni ta 'kjarifika tista' ssir permezz ta 'filtrazzjoni ta' fluss normali (NFF, magħrufa wkoll bħala filtrazzjoni dead-end) jew filtrazzjoni tanġenzjali ta 'fluss (TFF, magħrufa wkoll bħala filtrazzjoni ta' fluss inkroċjat). Hemm ukoll modi ta 'filtri speċifiċi (filtri fil-fond) li fihom materjali ċċarġjati b'mod pożittiv u AIDS tal-filtru li jtejbu ż-żamma ta' debris taċ-ċelluli, kollojdi, u komponenti mhux mixtieqa ċċarġjati b'mod negattiv.
Il-filtri tal-membrana jżommu partiċelli bl-esklużjoni tad-daqs u m'għandhomx kapaċità għolja ta 'żamma tal-ħmieġ, għalhekk huma adattati għal passi ta' kjarifika sekondarja. Kemm il-filtri fil-fond kif ukoll il-filtri tal-membrana huma faċli biex jiġu skalati u implimentati (disinn sempliċi tas-sistema). B'differenza mill-NFF, it-TFF jintuża prinċipalment għall-kjarifika primarja (mikrofiltrazzjoni). Membrani b'firxa ta 'qtugħ ta' 0.1-0.65 μm (preferibbilment b'kanal miftuħ) intużaw b'suċċess biex iżommu ċelloli, debris taċ-ċelluli, u kontaminanti kbar oħra. Il-biċċa l-kbira tat-tagħmir TFF huwa skalabbli b'mod lineari u jista 'jerġa' jintuża wara t-tindif, li jnaqqas b'mod sinifikanti l-ispiża tal-konsumabbli għall-pass.
Il-pass tal-kjarifika jinsab bejn il-proċessi upstream u downstream u xi drabi jiġi injorat waqt l-iżvilupp tal-proċess tal-vaċċin minħabba li l-ħin u r-riżorsi huma prijoritizzati għal passi oħra ta 'purifikazzjoni, bħall-kromatografija jew iċ-ċentrifugazzjoni tal-gradjent tad-densità.
Anki l-privattivi għall-proċessi tal-manifattura tal-vaċċini spiss iħallu barra l-pass ta 'kjarifika. L-effiċjenza li tiċċara taffettwa direttament il-prestazzjoni tal-proċess downstream. Pass ta 'kjarifika ottimizzat ħażin jista' jaffettwa b'mod negattiv il-kapaċità tal-filtru sterilizzat jew jista 'jqassar il-ħajja tas-servizz tar-reżina kromatografika. Illum, aspettattivi regolatorji aktar stretti għandhom it-tendenza li jġiegħlu lill-manifatturi tal-vaċċini jipproduċu vaċċini aktar puri, karatterizzati tajjeb iżda affordabbli. F'dan il-każ, kull pass jeħtieġ li jingħata l-attenzjoni li jixirqilha. Ix-xejriet attwali jissuġġerixxu li l-proċess upstream miexi lejn sistema ta' espressjoni "aktar nadifa" (jiġifieri ċelloli kkultivati f'midja ħielsa mis-serum jissostitwixxu l-bajd) b'produttività miżjuda u densità taċ-ċelluli ogħla.
Il-proċessi ta 'purifikazzjoni downstream qed jiġu ssimplifikati u ssimplifikati biex tiżdied il-purità tal-prodott finali. Biex timmaniġġja dawn il-bidliet, il-pass ta' kjarifika ma jistax isir ostakolu. F'dan il-każ, it-teknoloġija tal-filtrazzjoni tiltaqa 'ma' sfida ġdida ta 'kjarifika, li tindirizza l-kwistjonijiet ta' flessibilità akbar tal-proċess, il-possibbiltà ta 'użu wieħed, u spejjeż ta' investiment imnaqqsa.
02 Kjarifika tal-vaċċini tal-virus
Diversi tipi ta 'metodi ta' kjarifika, jew waħedhom jew flimkien, intużaw b'suċċess biex jiċċaraw il-ħsad fl-aħħar tal-għalf tal-vaċċini.
Skala pilota:1-20L, skala ta' produzzjoni: aktar minn 20L
2.1 Prekawzjonijiet għall-kjarifika tal-vaċċin tal-virus
Ħafna vaċċini fihom il-partiċelli tal-virus kollha jew parti minnhom biex jiffurmaw immunità kontra infezzjoni virali. Ġeneralment jaqgħu f'erba' kategoriji wesgħin:
Vaċċin ħaj attenwat (LAV), li huwa bbażat fuq razza mdgħajfa tal-virus biex tnaqqas il-virulenza tiegħu. Virusijiet attenwati jistgħu jirreplikaw fil-ġisem iżda mhumiex patoġeniċi.
- Vaċċini tal-virus inattivat (IV), li jkun fihom viruses inattivati kimikament jew ultravjola biex jeliminaw l-infettività. Il-partiċelli tal-virus jistgħu jkunu kompluti, diviżi jew purifikati (proteini antiġeniċi biss).
- Il-vaċċin tal-vettur virali (VV) huwa virus attiv, mhux patoġeniku li jippreżenta l-antiġen ta' virus patoġeniku. Dawn l-istrutturi żviluppati reċentement jintużaw ukoll għal applikazzjonijiet ta 'terapija tal-ġeni.
Vaċċini ta 'partiċelli li jixbħu lill-virus (VLPs), klassi speċifika ta' vaċċini ta 'subunità virali li jimitaw l-istruttura ġenerali tal-partiċelli virali iżda ma fihomx materjal ġenetiku infettiv.
Fil-biċċa l-kbira tal-każijiet, il-partiċelli virali huma kompletament intatti matul il-pass ta 'kjarifika, anke waqt il-liżi tal-vaċċin virali (il-qsim normalment isir 'l isfel, f'ambjent aktar purifikat).
L-isfida ewlenija tal-kjarifika virali hija l-irkupru ta 'partiċelli virali b'rendiment għoli filwaqt li tneħħi b'mod effiċjenti debris taċ-ċelluli, aggregati kbar u kontaminanti li ma jinħallux. Kif deskritt fit-taqsimiet li ġejjin, hemm diversi fatturi li jistgħu jikkawżaw degradazzjoni jew telf tal-virus. Barra minn hekk, ir-rendiment virali jista 'jkun diffiċli li wieħed joqgħod fuqu minħabba l-varjabbiltà għolja ta' metodi ta 'assaġġ kwantitattiv virali f'dan l-istadju tal-proċess, speċjalment għal vaċċini LAV u VV. Għal dawn il-vaċċini, ir-rendiment virali huwa spiss evalwat bl-użu ta 'testijiet ta' infettività bħat-test tal-plakka jew it-test TCID 50. Il-fatt li xi wħud mill-komposti maħsuda jistgħu jinterferixxu mal-kapaċità tal-virus li jinfetta ċelluli indikattivi jżid il-varjabbiltà ta 'dan l-approċċ kwantitattiv.
2.2 Strateġija ta' kjarifika tal-vaċċin tal-virus
Il-vaċċini virali jvarjaw ħafna fid-daqs, l-istruttura, il-forma u s-sistemi tal-espressjoni (Tabella 3).
Bħala riżultat, ġeneralment m'hemm l-ebda mudell għall-proċessi downstream tiegħu, speċjalment il-passi ta' kjarifika. Fit-teorija, it-tekniki kollha disponibbli (ċentrifugazzjoni b'veloċità baxxa, mikrofiltrazzjoni TFF, NFF) jistgħu jintgħażlu u potenzjalment jiġu kkombinati biex jiċċaraw il-virus. Fil-fatt, is-suċċess tal-metodi ta 'kjarifika huwa influwenzat mis-sistema ta' espressjoni u l-proprjetajiet fiżikokimiċi tal-viruses involuti.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{{0}} ċelluli /ml) metodu ta 'kjarifika, bl-użu ta' polimeri katjoniċi, naqqas iż-żona ta 'filtrazzjoni profonda b'4 darbiet meta mqabbel ma' metodi tradizzjonali. Din it-teknika tippermetti l-ħsad ta 'fermentaturi ta' kapaċità kbira mingħajr l-użu ta 'ċentrifugi. Bl-istess mod, Riske et al. wera li t-trattament ta 'chitosan ta' 40 L kulturi taċ-ċelluli (0.02%) li fihom 1.4-2.6% solidi wasslu għal żieda 7-darbiet fil-kapaċità assoluta tal-filtru wara filtrazzjoni fil-fond.
Jsemmu wkoll li l-chitosan jidher li jtejjeb l-effiċjenza tal-kjarifika billi jifflokula partiċelli submicron, li tipikament joqgħodu fiċ-ċentrifugi. Metodi ta' trattament minn qabel u flokulazzjoni x'aktarx li jkomplu jkunu parti minn kjarifiki futuri dwar il-filtrazzjoni tal-vaċċin. Penetranti, inklużi zokkor, glycols, u aċidi amminiċi, preferenzjali flocculate viruses. Flokulazzjoni virali b'soluzzjoni osmotika segwita minn 0.2µ mikrofiltrazzjoni tista' tintuża bħala proċess komprensiv għall-purifikazzjoni tal-virus. Il-penetranti jistgħu jistimulaw l-aggregazzjoni virali billi jnaqqsu s-saff ta 'idratazzjoni madwar il-partiċelli biex jgħaqqdu partiċelli tal-virus idrofobiċi mhux inkapsulati u partiċelli tal-virus inkapsulati. Għalkemm il-penetranti ġew murija li flokkulat viruses, il-metodu għandu l-potenzjal li jkun pjattaforma għall-purifikazzjoni tal-vaċċin fil-futur, u l-fattibilità tiegħu fil-purifikazzjoni pilota jew fuq skala kbira tal-vaċċin ma ġietx ippruvata. Il-metodu tat-trattament minn qabel tal-flokulazzjoni, li x'aktarx ikompli jkun parti mill-kjarifika futura tal-filtru tal-vaċċin, jitwettaq f'fermentatur 2L. Sabiex potenzjalment jintużaw f'operazzjonijiet ta 'produzzjoni fuq skala kbira, dawn il-metodi jeħtieġ li jiġu vvalidati fuq skali pilota u ta' produzzjoni.
2.2.1 L-espressjoni tal-impatt tas-sistema
Il-metodu ta 'kjarifika jiddependi prinċipalment fuq it-tip ta' proċess upstream u sistema ta 'espressjoni, li jiddetermina t-tip u l-livell ta' kontaminanti li għandhom jitneħħew. Vaċċini virali huma ġeneralment prodotti f'embrijuni tat-tiġieġ minn linji ta 'ċelluli kontinwi ta' mammiferi jew għasafar jew ċelluli bakulovirus/insetti, li huma sistema ta 'espressjoni aktar kumplessa. Xi tipi ta 'VLPs jistgħu wkoll jiġu prodotti minn sistemi ta' espressjoni eteroloġi oħra (batterji, ħmira, ċelloli tal-pjanti).
2.2.1.1 Virus prodott fl-embrijun tat-tiġieġ
Il-vaċċini ġew prodotti fil-bajd għal għexieren ta 'snin. Dan ix-xogħol imur lura għall-1931, meta Woodruff u Good Pasture użaw b'suċċess il-membrana chorio-allantoic tal-bajd fertili bħala sottostrat għat-tkabbir virali. Illum, ħafna vaċċini umani u veterinarji għadhom prodotti bl-użu ta 'dan il-proċess antik. L-iktar magħruf huwa probabbilment il-vaċċin tal-influwenza staġjonali. Il-prinċipju huwa li l-bajd tat-tiġieġ jiġi mlaqqam b'viruses ta 'interess u mbagħad jiġi replikat fil-membrana chorio-allantoic. Wara r-riproduzzjoni, il-fluwidu allantojku rikk f'partiċelli virali jinġabar u jiġi purifikat.
Il-fluwidu allantojku huwa għalf li jiċċara sfida. Il-kontenut għoli ta 'minerali u proteini tiegħu (inkluż l-ovalbumin) jagħtiha viskożità għolja. Il-fluwidu allantojku fih ukoll komposti essenzjali tat-tessuti minn embrijuni tat-tiġieġ, bħal rix, munqar, vini jew ċelluli tad-demm. Minħabba l-kontenut għoli ta 'solidi, ċentrifugazzjoni b'veloċità baxxa hija l-għażla preferuta għall-kjarifika primarja, li tipikament tirriżulta f'rata ta' rkupru ta 'madwar 70%. Madankollu, kjarifika primarja bl-użu ta 'tekniki ta' filtrazzjoni hija wkoll possibbli. Għall-NFF, il-filtri fil-fond ibbażati fuq il-polipropilene u ċ-ċelluloża għandhom kapaċitajiet tajbin ta 'ġbir ta' fluwidu allantojku. Filtri tal-wiċċ magħmulin minn polipropilene jew filtri tal-fond ibbażati fuq iċ-ċelluloża jista' jkollhom kapaċità ta' 150-210 L/m² u jnaqqsu t-turbidità tal-fluss tal-għalf sa 3 darbiet. L-apparat TFF tal-kanal tal-għalf miftuħ huwa adattat ukoll għall-kjarifika tal-fluwidu allantoic, peress li l-apparat huwa aktar adattat għal telf ta 'pressjoni minimu permezz tal-kanal tal-għalf, u b'hekk inaqqas l-imblukkar tal-kanal.
Il-pass sekondarju ta' kjarifika jista' jsir faċilment bl-NFF. Taħlita ta 'polipropilene, ċelluloża u materjali tal-fibra tal-ħġieġ ġeneralment turi effiċjenza tajba, u alternattiva għall-pass ta' kjarifika sekondarja hija li tuża TFF u apparat tal-membrana ta 'mikrofiltrazzjoni {{0}}.65μm jew 0.45μm u topera fluss osmotiku kontroll. Apparat TFF ta 'kanal miftuħ b'PVDF idrofiliku jew membrana idrofilika PES jista' jintuża f'dan il-pass.
Huwa importanti li wieħed jinnota li partiċelli virali jistgħu jkunu assoċjati ma 'materjal debris li ma jinħallx, li jista' jnaqqas b'mod sinifikanti l-produzzjoni virali waqt il-kjarifika. L-użu ta 'soluzzjoni tal-melħ jista' jnaqqas din l-assoċjazzjoni bejn viruses tal-influwenza u frammenti solidi, li jirriżulta f'żieda bejn wieħed u ieħor darbtejn fil-produzzjoni mingħajr ma taffettwa l-integrità tal-partiċelli virali.
2.2.1.2 Virusijiet prodotti f'linji ta' ċelluli suċċessivi tal-mammiferi u tat-tjur
Riċentement, xi vaċċini virali tbiegħdu minn proċessi bbażati fuq il-bajd favur proċessi bbażati fuq il-kultura taċ-ċelluli (speċjalment għal vaċċini tal-influwenza). Ir-raġuni ewlenija għal dan il-bidla hija li jiġu evitati problemi ta' produzzjoni ta' vaċċini assoċjati mal-bajd embrijoniku (jiġifieri nuqqas ta' provvista ta' bajd li jista' jseħħ fil-każ ta' xi tifqigħa ta' mard tat-tjur). Bħala riżultat, ħafna tipi ta 'vaċċini u vettori virali bħalissa huma żviluppati bl-użu ta' linji ta 'ċelluli kontinwi minn mammiferi jew għasafar, linji ta' ċelluli konvenzjonali (bħal linji ta 'ċelluli Vero, MDCK, jew HEK293), jew linji ta' ċelluli proprjetarji.
Skont is-sistema ta’ espressjoni, il-virus jista’ jibqa’ ġewwa ċ-ċellula, u jeħtieġ pass ta’ liżi taċ-ċellula, jew jista’ jibqa’ barra miċ-ċellula (liżi jew bidu). It-tagħbija solida u l-kontenut solubbli miksuba mill-kultura taċ-ċelluli huma ħafna aktar nodfa mill-fażi likwida allantojka. Bħala riżultat, it-teknoloġija NFF hija aktar faċli biex tiġi implimentata u l-kapaċità hija ogħla b'mod sinifikanti. Madankollu, il-kapaċità tal-filtrazzjoni hija dipendenti ħafna fuq il-kundizzjonijiet tal-kultura taċ-ċelluli, bħad-densità taċ-ċelluli jew il-vijabbiltà taċ-ċelluli fil-ħsad. Dawn il-parametri jaffettwaw l-ammont ta 'debris taċ-ċelluli u makroaggregati li jistgħu jinstaddu filtri u membrani fil-fond, li jirriżultaw f'kapaċità mnaqqsa.
Thomassen et al jipprovdu eżempju tajjeb ta' kjarifika tal-NFF. Użat fil-proċess tal-produzzjoni tal-poljovirus inattivat (IPV). Ċelloli Vero kkultivati fuq microcarriers intużaw għall-proliferazzjoni virali b'densità taċ-ċelluli ta' {{0}}.78 x 106 ċelluli /ml TOI. Skrin ta 'l-istainless steel ta' 75μm jintuża għall-kjarifika minn qabel biex jitneħħew il-mikrocarriers mill-ħsad. Il-gradazzjoni b'saff doppju hija ċċarata bl-użu ta 'filtru fond ta' densità (0.2-2.0μm), segwit minn filtru ta 'grad sterilizzat.
L-unità li jintremew skalabbli magħżula ntużat b'suċċess għall-preparazzjoni ta 'materjal ta' prova klinika Sabin IPV fuq skala 350 L. Skont is-serotip tal-virus, tinkiseb rata ta' rkupru tal-virus ta' 86 sa 96 fil-mija.
2.2.1.3 Partiċelli li jixbħu l-bakulovirus/virus prodotti fis-sistema taċ-ċelluli tal-insetti
Il-konsiderazzjoni ta 'sistemi ta' ċelluli bakulovirus/insetti għall-produzzjoni ta 'vaċċini fuq skala kbira hija relattivament ġdida, iżda qed tattira interess dejjem jikber fil-qasam ta' vettori virali u VLPs. Il-benefiċċju ewlieni ta 'din is-sistema huwa li tinvolvi produzzjoni ta' ħajja qasira (l-ebda ħtieġa li jiġu stabbiliti linji taċ-ċelluli) u sikur (l-ebda DNA virali komplut). Hemm ukoll xi żvantaġġi, bħall-ħtieġa għat-tneħħija tal-bakulovirus u l-istabbiltà tal-prodott.
Cervarix, vaċċin VLP kontra l-infezzjoni tal-papillomavirus uman prodott minn GlaxoSmithKline, huwa l-ewwel vaċċin uman li jiġi prodott kummerċjalment fiċ-ċelloli tal-insetti. Għadd ta' vaċċini bbażati fuq VLPs u rAAV vettori prodotti f'ċelluli ta' insetti infettati b'baculovirus bħalissa qed jiġu żviluppati. Linji taċ-ċelluli tal-insetti derivati mid-dud tal-armata tal-ħarifa Spodoptera frugiperda (Sf9 u Sf21) u d-dudu tal-kaboċċi Trichoplusia ni (ċelluli BTI-TN5B1-4) huma l-aktar użati komunement minħabba l-kapaċità tagħhom li jikbru f'sospensjoni, li tissimplifika l-amplifikazzjoni tal-upstream. proċess. Wara li jikbru sad-densità mixtieqa ta 'ċelluli ħajjin, dawn iċ-ċelloli huma infettati b'baculovirus rikombinanti fil-fażi ta' tkabbir esponenzjali taċ-ċelluli għall-espressjoni tal-proteini. Il-ġenoma kbir ta 'baculoviruses jippermetti l-espressjoni ta' ħames proteini differenti jew aktar, li jaqbel mal-kumplessità ta 'VLP u vettori virali.
Bernard et al. iddeskriva l-proċess downstream tal-kultura taċ-ċelluli tal-insetti. Il-proċess huwa varjabbli ħafna, li jirrifletti d-diversità ta 'proteini prodotti b'din it-teknika. L-ewwel pass tas-sekwenza tal-purifikazzjoni huwa influwenzat ħafna mill-karatteristiċi tal-volum tal-bijoreattur (jiġifieri, id-densità taċ-ċelluli u l-vijabbiltà), jew min-natura tar-rilaxx tal-prodott (sekreġjat permezz tal-bidu jew il-liżi taċ-ċelluli). Infezzjoni tal-bakulovirus taċ-ċelluli tal-insetti tista' tikkawża liżi taċ-ċelluli fi żmien 3-5 ijiem. Il-qerda taċ-ċelloli tista 'twassal għal żieda fl-attività proteolitika u fatturi ambjentali oħra li jistgħu jwasslu għad-degradazzjoni ta' proteini rikombinanti.
Kien hemm tentattivi biex jiġu żviluppati bakuloviruses b'kapaċità aktar baxxa li tibda l-liżi taċ-ċelluli. Il-baculovirus lyses inqas minn 10 fil-mija tal-insetti infettati.
Il-liżi taċ-ċelluli tista 'titwettaq bl-użu ta' metodi differenti, bħal friża-tidwib, deterġenti, omoġenizzaturi, jew trattament bl-ultrasound. Iċ-ċelloli tal-insetti m'għandhomx ħajt taċ-ċelluli u għalhekk jinħall malajr. Għalkemm it-trattament ultrasoniku ġie rrappurtat f'ħafna proċessi tal-bank, rarament jintuża fuq skala sperimentali jew kummerċjali. L-aktar metodu komuni huwa li tuża omoġenizzatur biex teqred iċ-ċelloli fil-preżenza ta' deterġent b'konċentrazzjoni baxxa (0.1% Triton X-100 jew NP-40). L-użu ta 'deterġenti u mikrofluidizzazzjoni jew omoġenizzazzjoni tal-impatt osmotiku ġew impjegati b'suċċess f'ħafna proċessi ta' manifattura fuq skala kbira. Tipikament, iċ-ċelloli tal-insetti huma sospiżi f'liżi buffers (50 mM TRIS pH7.7, 300 mM NaCl, 5% gliċerol, 0.2 mM PMSF, u inibituri tal-protease), li matulhom Triton-X100 huwa miżjud ma 'konċentrazzjoni finali ta' 0.1%, segwit minn ultrasound ħafif jew mikrofluidizzazzjoni. It-taħlita mbagħad tiġi ċentrifugata biex tneħħi partiċelli li ma jinħallux.
F'dan l-istadju, il-lisat jista 'jidher imċajpra ħafna u huwa diffiċli biex jiġi ffiltrat bl-użu ta' filtru 0.45μm. Xi drabi telf sa 30% jista 'jiġi osservat waqt il-pass ta' kjarifika tal-piroliżi. Iż-żieda ta 'benzoenzymes fl-istadju tal-qsim tgħin biex issolvi l-problema tal-filtrazzjoni. It-tindif taċ-ċelloli b'salmura buffered fosfat wara l-ħsad u "freeze-thaw" rapidu f'melħ għoli (500mM NaCl) li jkun fih il-buffer tal-qsim jgħin biex jitneħħew l-aggregati.
Il-kjarifika ta 'VLPs u vettori virali prodotti minn ċelluli ta' insetti sseħħ wara liżi taċ-ċelluli (bi trattament kimiku jew mekkaniku), li tirrilaxxa mhux biss partiċelli virali iżda wkoll ammonti kbar ta 'aċidu nuklejku ċellulari. Iċ-ċelloli ta' l-insetti jistgħu jikbru b'densità għolja ta' ċelluli, minn 1-9.10 6 ċelluli/ml. Għalhekk, il-pass ta 'kjarifika għandu jittratta densità għolja taċ-ċelluli, kontenut għoli ta' aċidu nuklejku u, jekk possibbli, tneħħija ta 'partiċelli ta' bakulovirus. Biex tagħmel l-affarijiet aktar ikkumplikati, VLPs jew vettori virali u baculoviruses jista' jkollhom daqsijiet simili (bakuloviruses huma 60-80 nanometri wiesgħa u 300-400 nanometri twal). Minħabba d-densità għolja taċ-ċelluli, iċ-ċentrifugazzjoni kienet it-teknika preferuta għall-kjarifika primarja għal għexieren ta 'snin. Madankollu, il-proċessi tal-membrana jidhru li huma alternattiva attraenti ħafna minħabba li l-iskalabbiltà hija faċli biex tiġi definita.
Filtri profondi ntużaw b'mod effettiv fil-proċess downstream ta 'partiċelli li jixbħu rotavirus bi tliet saffi. Fil-livell tal-laboratorju, il-metodu ta 'ultraċentrifugazzjoni tal-gradjent tad-densità CsCl ħafna drabi jintuża biex jippurifika dawn il-partiċelli kumplessi. Ir-riċerkaturi evalwaw mhux biss il-pass ta 'kjarifika tal-filtru fond, iżda wkoll il-proċess kollu downstream (qsim ta' Triton X-100 u filtrazzjoni fil-fond, segwit minn ultrafiltrazzjoni u esklużjoni tad-daqs tal-partiċelli). Ir-riżultati juru li r-rendiment tal-gradjent tad-densità CsCl jista 'jilħaq 37%.
Il-metodu ultra-ċentrifugali huwa madwar 10%. Bħala eżempju ieħor, fibri vojta minn ġewwa ta '0.45μm u fibri ta' dijametru fin ta '500 kDa intużaw biex jirkupraw u jikkonċentraw partiċelli simili għall-HIV prodotti fiċ-ċelloli tal-insetti. F'dan l-istudju, il-forza ta 'shear tal-fibri vojta ġiet ottimizzata bbażata fuq l-integrità taċ-ċelluli. Riżultati Ġie stabbilit proċess ta 'shear force baxx biex jissostitwixxi l-ultraċentrifugazzjoni tal-gradjent taz-zokkor tal-mejda.
Il-proċess għandu l-potenzjal li jiġi applikat għall-produzzjoni tal-massa. Filtri profondi ntużaw ukoll b'suċċess fil-produzzjoni ta 'viruses adeno-assoċjati rikombinanti. Il-liżi taċ-ċelluli twettqet b'jammer taċ-ċelluli mekkaniċi b'żewġ pistons, segwit minn trattament tan-nukleażi. Fil-pass ta 'kjarifika, intuża element ta' filtru tal-fibra tal-ħġieġ fil-fond ta '1.2μm, segwit minn żewġ saffi ta' 0.8μm PES idrofiliku u 0.2μm PES idrofiliku. Filtri ta' daqs proporzjonali jintużaw għal lottijiet ta' proċess minn daqsijiet iżgħar għal 200 L. Filtri profondi ntużaw b'suċċess, u klassifikazzjonijiet TFF b'films ċatti jew fibri vojta minn ġewwa ta' 0.2µm jew 0.45µm ġew irrappurtati wkoll li huma effettivi ħafna.
L-istudju minn Tecnologica (IBET) fl-Istitut Oeiras tal-Bijoloġija Sperimentali fil-Portugall uża NFF biex iwettaq kjarifika tal-epatite C VLP espressa minn baculoviruses mingħajr ċentrifugazzjoni. Filtri tal-polypropylene nominali nominali (10,5,0.6 u 0.3μm) filtri huma użati biex jiċċaraw il-ħsad tal-VLP. L-istess filtri bi klassifikazzjonijiet tal-pori 0.6μm u 0.3μm jintużaw għall-filtrazzjoni fiċ-ċentri tal-ħsad tal-VLP. Il-filtrati kollha studjati ġew ittestjati għar-rati ta 'rkupru ta' HCV-VLP u tqabblu l-metodi ta 'filtrazzjoni rakkomandati. Ir-riżultati huma murija fit-Tabella 4.
Ir-riżultati wrew li l-filtru 5μm-0.3μm kellu l-ogħla prodott irkupru (100%) għal għalf VLP tal-epatite C maħsud direttament. Il-filtru tal-polypropylene 0.6μm kellu l-ogħla prodott irkupru (82%) għall-għalf ċentrali, u t-tneħħija tad-DNA taċ-ċellula ospitanti kienet ta 'madwar 70%.
2.2.1.4 Partiċelli bħal virus prodotti f'sistemi batterjali jew tal-ħmira
It-tip ta' metodu ta' kjarifika għal vaċċini VLP espressi f'sistemi batterjali jew tal-ħmira jiddependi fuq ir-rilaxx ta' VLP għal medjaturi extraċellulari. Jekk il-VLPs ma jistgħux jiġu rilaxxati b'mod effiċjenti, jistgħu jkunu meħtieġa liżi taċ-ċelluli jew passi oħra ta 'estrazzjoni qabel il-pass attwali ta' kjarifika. Filwaqt li dan huwa l-istandard tad-deheb fl-industrija tal-kjarifika tal-proteini, ċentrifugazzjoni (kontinwa jew lott) espressa f'sistemi batterjali jew ibbażati fuq il-ħmira, aktar reċentement, il-proċessi tal-membrana saru alternattiva attraenti ħafna minħabba l-faċilità tagħhom ta 'skalabbiltà u kompatibilità ma' użu wieħed trattamenti.
Richter u Topell jispjegaw l-użu taċ-ċentrifugazzjoni, TFF, jew taħlita tat-tnejn meta jippreparaw VLPs prodotti f'E. coli ċċarati. Fix-xogħol tagħhom, 0.45m membrani TFF intużaw biex iħalltu u jiċċaraw l-omoġenati ta 'E. coli omoġenizzati f'temperatura ta' 5 gradi. Huma jinnotaw ukoll li TFF ibbażat fuq membrana huwa adattat għall-immaniġġjar ta 'ħsad ta' viskożità għolja, preferibbilment bl-użu ta 'unitajiet TFF b'konfigurazzjonijiet ta' kanal miftuħ.
Il-kjarifika ċentrifugali ġiet evalwata wkoll bħala alternattiva għat-TFF. F'dan il-każ, l-omoġenat li jirriżulta ma ġiex dilwit u ċentrifugat f'4 gradi għal 105 minuti, 10000g. Mingħajr ma ttrasferixxi l-kisja ratba, is-supernatant ġie mferra 'l barra mill-partiċelli u ċentrifugat mill-ġdid f'4 gradi u 10,000 g għal 60 min. Is-supernatant imbagħad tneħħa mill-partiċelli preżenti, dilwit b'buffer EB (43.89 mM Tris HCl, 6.11 mM Tris Base, 5.0 mM EDTA, 10% (v/v) Triton X-100) 1:2, u ffiltrat fuq apparat ta’ filtru sterili ta’ 0.22 m. Aktar ipproċessar. Il-proċess ta 'scale-up għall-produzzjoni ta' dan il-vaċċin VLP f'E. coli fuq skala 800L ġie rrappurtat ukoll iċċarat bil-kombinazzjoni ta 'ċentrifugazzjoni u TFF.
Il-vaċċin rikombinanti tal-epatite E HEV 239 ġie liċenzjat fiċ-Ċina għall-immunizzazzjoni tal-adulti minn 16-il sena 'l fuq. L-antiġeni tat-tilqim (VLP) huma espressi f'E. coli, u l-iskala tal-proċess tal-produzzjoni tal-antiġen intwera li hija fuq skala ta' 50L. Il-prodott ġie estratt bil-qsim ta' E. coli u l-korpi ta' inklużjoni ġew isseparati mill-frammenti taċ-ċelluli permezz ta' ħasil qawwi b'buffer li kien fih 2% Triton X-100 u mbagħad maħlul b'omoġenizzatur tal-urea 4 M. TFF jiċċara VLP tal-papillomavirus uman prodott f'Saccharomyces cerevisiae (15L). Il-lisat taċ-ċelluli ttrattat b'nukleażi ġie ċċarat permezz ta 'mikrofiltrazzjoni crossflow fil-modalità ta' trasfiltrazzjoni bl-użu ta 'filtru tal-fibra vojta minn ġewwa ta' 0.65 μm. L-istess proċess huwa użat fil-produzzjoni tal-vaċċin. Għalkemm numru żgħir biss ta 'vaċċini bbażati fuq VLP laħqu skala kummerċjali, bosta vaċċini bbażati fuq VLP qed jiżviluppaw, li ħafna minnhom huma ċċarati bl-użu ta' ċentrifugazzjoni jew teknoloġija tal-membrana.
Limitat mill-influwenza tal-ispazju, aħna se naqsmu t-tieni nofs tal-kontenut fil-kapitolu li jmiss. Fl-artikolu li jmiss, aħna se naqsmu xi każijiet ta 'kjarifika tal-vaċċin u l-użu ta' komponenti tal-membrana rilevanti.
Bħala l-ewwel kumpanija fiċ-ċirkwit tal-lokalizzazzjoni, Guidling Technology akkumulat biżżejjed esperjenza rilevanti fil-kjarifika tal-vaċċin. Guidling Technology hija kumpanija ta 'żvilupp u produzzjoni li tiffoka fuq kultura, purifikazzjoni u separazzjoni bijofarmaċewtika u taċ-ċelluli. Il-prodotti jintużaw ħafna fil-bijomediċina, dijanjosi, filtrazzjoni ta 'fluwidu industrijali, skoperta, kjarifika, purifikazzjoni u proċess ta' konċentrazzjoni; Guidling żviluppa b'suċċess tubu ċentrifugu ta 'ultrafiltrazzjoni, cassette tal-membrana ta' ultrafiltrazzjoni/mikrofiltrazzjoni, filtru għat-tneħħija tal-virus, apparat tal-filtru tal-fluss tanġenzjali, munzell tal-membrana fil-fond, eċċ., Li jissodisfaw bis-sħiħ ix-xenarji ta 'applikazzjoni tal-kultura bijofarmaċewtika u taċ-ċelluli.
Il-membrani u l-filtri tal-membrana tagħna jintużaw ħafna f'konċentrazzjoni, estrazzjoni u separazzjoni ta 'prefiltrazzjoni, mikrofiltrazzjoni, ultrafiltrazzjoni u nanofiltrazzjoni. Il-firxa wiesgħa tagħna ta 'linji ta' prodotti, minn filtrazzjoni żgħira tal-laboratorju li tintuża darba għal sistemi ta 'filtrazzjoni tat-tip ta' produzzjoni, ittestjar ta 'sterilità, fermentazzjoni, kultura taċ-ċelluli u aktar, tista' tissodisfa l-ħtiġijiet ta 'ttestjar u produzzjoni.
